3.2. Biểu hiện các cecropin tái tổ hợp
3.2.2. Xử lý cặn tế bào và thu nhận cecropin dung hợp dạng tan
Sử dụng điều kiện biểu hiện tối ưu đã chuẩn được cho GST-cecropin trong cả hai chủng E.
coli BL21 (DE3) và E. coli JM109; His+GST-cecH, His+GST-cecN và Trx-cecropin trong
chủng E. coli BL21 (DE3), chúng tôi tiến hành biểu hiện lượng lớn để thu lấy cặn tế bào. Cặn này sẽ được xử lý để giải phóng protein của tế bào trong đó có cecropin dung hợp. Thơng thường có 2 cách xử lý để thu dịch protein tổng số là: xử lý khơng biến tính (với các loại protein đích ở dạng tan) và xử lý biến tính (sử dụng các chất biến tính như SDS, ure, sarcozyl, ... để làm tan protein đích dạng thể vùi). Với mong muốn thu cecropin tinh sạch sau khi loại bỏ Tag không bị ảnh hưởng bởi quá trình xử lý biến tính nên chúng tơi thử ở điều kiện khơng biến tính trước với tất cả các loại cecropin dung hợp đã có. Nếu cecropin dung hợp ở dạng thể vùi thì sẽ được xử lý biến tính với SDS và ure ở các nồng độ khác nhau. Kết quả xử lý khơng biến tính protein dung hợp của cecH được trình bày trên Hình 29.
Hình 29. Kết quả điện di protein tổng số sau xử lý khơng biến tính các protein dung hợp của
cecH: GST-cecH (A), His+GST-cecH (B) trên gel SDS-PAGE 10% và Trx-cecH (C) trên gel SDS-PAGE 12%. Giếng CƯ: cặn tế bào biểu hiện, S: phần dịch sau xử lý; P: phần cặn sau xử lý.
Kết quả thu được cho thấy sau khi xử lý khơng biến tính, GST-cecropin và His+GST- cecropin hầu hết nằm ở dạng thể vùi (Hình 29A và 29B); trong khi đó, Trx-cecropin có một nửa nằm ở dạng tan (Hình 29C). Chính vì vậy, GST-cecropin và His+GST-cecropin sẽ tiếp tục được chuẩn điều kiện xử lý biến tính để thu được protein dung hợp ở dạng tan.
Chúng tơi lựa chọn 2 hóa chất làm tan protein dạng thể vùi hay được sử dụng là SDS và ure [36, 40]. Khi thay đổi nồng độ SDS từ 0.1% đến 0.5%, chúng tôi nhận thấy SDS 0.5% làm tan được 3/4 lượng protein GST-cecH (Hình 30A). Tương tự như vậy, chúng tôi tiến hành thử với ure trong dải nồng độ từ 1 M đến 8 M. Kết quả cho thấy chỉ đến khi ure ở nồng độ 8 M thì mới thu được 1 nửa protein GST-cecH ở dạng tan (Hình 30B), nhưng His+GST-cecH thì vẫn tồn tại ở dạng không tan (Hình 30C). Trong khi ure 8 M là nồng độ cao nhất được sử dụng để làm tan protein. Vì vậy, chúng tơi tạm thời chưa nghiên cứu tiếp với His+GST-cecH và His+GST-cecN nữa.
Hình 30. Kết quả điện di protein tổng số sau xử lý biến tính các protein dung hợp của GST-
cecH với SDS (A), GST-cecH với ure (B), His+GST-cecH với ure (C) biểu hiện trong chủng
E. coli BL21 (DE3) trên gel SDS-PAGE 10%. Giếng S0.5: phần dịch sau xử lý với SDS
0.5%; P0.5: phần cặn sau xử lý với SDS 0.5%; SU1, SU3, SU5, SU6, SU7, SU8: phần dịch sau xử lý với ure ở nồng độ 1, 3, 5, 6, 7, 8 M; PU1, PU3, PU5, PU6, PU7, PU8: phần cặn sau xử lý với ure ở nồng độ 1, 3, 5, 6, 7, 8 M; M: Precision Plus Protein™ Unstained Standards Bio Rad.
Các phần dịch protein tổng số sau xử lý có chứa protein dung hợp cecropin được dùng để tiến hành tinh sạch bằng cột sắc ký ái lực tương ứng. Phần dịch chứa Trx-cecropin thu được từ xử lý khơng biến tính được sử dụng trực tiếp để tinh sạch theo kiểu khơng biến tính. Trong khi đó các phần dịch chứa GST-cecropin sau xử lý biến tính được tinh sạch theo hai phương pháp khác nhau là tinh sạch khơng biến tính (thẩm tách loại bỏ SDS, ure rồi tinh sạch) và tinh sạch biến tính (giữ nguyên SDS, ure để tinh sạch) nhằm so sánh hiệu suất tinh sạch của 2 phương pháp này.