Phân nhóm bệnh nhân theo các đặc điểm bệnh học của ung thư vú

TT Đặc điểm Số bệnh nhân Tỉ lệ % TT Đặc điểm Số bệnh nhân Tỉ lệ %

1. Độ tuổi 5. Mức độ xâm lấn (giai đoạn T)

< 50 38 38% T1-2 82 81,2%

≥ 50 62 62% T3-4 19 18,8%

2. Kích thước khối u (cm) 6. Mức độ hạch (giai đoạn N)

< 5 47 46,1% N0 56 55,4%

≥ 5 55 53,9% N1-2 45 44,5%

3. Số hạch 7. Kích thước hạch (cm)

< 10 75 73,5% ≤ 0,5 43 42,6%

≥ 10 27 26,5% > 0,5 58 57,4%

4. Mức độ biệt hóa 8. Giai đoạn bệnh

Cao 10 10,1% Giai đoạn 0 - II 80 79,2%

Vừa 66 66,7% Giai đoạn III - IV 21 20,8%

Trong đó, giai đoạn 0 - II bao gồm: T0-2N1M0 và T1-3N0M0, giai đoạn III - IV bao gồm: T0-4N2M0, T3-4N1M0, T4N0M0, Tbất kỳN3M0, Tbất kỳNbất kỳM1 [57]. Một số mẫu trong danh sách nghiên cứu khuyết một hoặc một vài đặc điểm bệnh học quan tâm: độ tuổi (thiếu 02), mức độ biệt hóa (thiếu 03), giai đoạn T (thiếu 01), giai đoạn N (thiếu 01), ích thước hạch (thiếu 01) và giai đoạn bệnh (thiếu 01).

Mẫu đối chứng bao gồm mẫu mô u tuyến vú lành tính và mẫu máu của 20 bệnh nhân được chẩn đoán mắc u tuyến vú lành tính do Khoa Giải phẫu bệnh - Tế bào, Bệnh viện K cung cấp và mẫu máu của 65 người cho máu bình thường do Khoa Sàng lọc máu, Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương cung cấp.

Các mẫu mô đựng trong ống eppendorf được vận chuyển trong Nitơ lỏng và bảo quản trong tủ lạnh sâu -80°C cho đến hi thực hiện nghiên cứu tiếp theo. Mẫu máu được đựng trong ống đựng máu chuyên dụng có chất chống đông và được bảo quản trong tủ lạnh -20°C cho đến khi sử dụng.

2.1.2. Hóa chất

Các hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu bao gồm: Kit tách chiết ADN tổng số và ADN plasmid của Qiagen (Đức). Các cặp mồi được cung cấp từ Integrated DNA Technologies (IDT, Mỹ). Thang chuẩn ADN, hỗn hợp dNTP, dung dịch gốc (mastermix) cho PCR của hãng Thermo Scientific (Mỹ). Các enzyme giới hạn của Fermentas. Kit nhân dòng trực tiếp sản phẩm PCR CloneJET PCR Cloning Kit từ hãng Thermo Scientific; chủng vi khuẩn E. coli DH5α của hãng Invitrogen. qPCRBIO SyGreen Mix của hãng PCR Biosystems (Anh). Các hóa chất khác đều đạt độ sạch phân tích cần thiết cho nghiên cứu sinh học phân tử.

2.1.3. Thiết bị

Các máy móc chính dùng trong nghiên cứu bao gồm: GeneAmp PCR system 9700 (Applied Biosystems), MyGo Pro Real-time PCR (IT-IS Life Science Ltd), tủ ấm nuôi vi khuẩn, máy lắc ổn nhiệt (Satorius), máy ly tâm lạnh 5417R (Eppendorf), thiết bị điện di ngang, điện di đứng (Biorad), hệ thống chụp ảnh điện di Geldoc (Biorad), tủ an toàn sinh học (Nuaire), hệ thống lọc nước loại vi khuẩn (Pyrex). Các thiết bị hác được sử dụng thuộc phòng Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc

nghiệm Sinh học người thuộc Bộ môn Sinh lý học và Sinh học người, Khoa Sinh học, Trường ĐHKHTN.

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Sơ đồ các bước thực hiện nghiên cứu được thể hiện trong Hình 2.1:

2.2.1. Tách chiết ADN tổng số

Tách chiết ADN tổng số từ mô

ADN tổng số từ mẫu mô được tách chiết bằng QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN, Đức) theo quy trình của nhà sản xuất. Các bước thực hiện như sau: - Mẫu mô được lấy ra từ tủ lạnh -80C, rã đông và rửa bằng đệm phosphate 100

mM, pH 8,0. Cân khoảng 25 mg mẫu mô và cắt thành những mảnh nhỏ đựng trong ống eppendorf.

- Bổ sung 180 µl đệm ATL và 20 µl proteinase K, trộn đều và ủ ở 56ºC trong khoảng 2 giờ đến qua đêm tùy hối lượng mẫu đến khi mẫu mô được thủy phân hoàn toàn.

- Thêm 200 µl đệm AL, trộn đều trong 15 giây, ủ ở 70ºC trong 10 phút. - Thêm 200 µl Ethanol 100%, trộn đều trong 15 giây.

- Cho dịch lên cột QIAamp Mini Spin. Ly tâm 8000 vòng phút trong 1 phút. Đặt cột vào ống eppendorf sạch và loại bỏ ống có chứa dịch.

- Bổ sung lên cột 500 µl đệm AW1. Ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dịch xuống cột.

- Bổ sung lên cột 500 µl đệm AW2. Ly tâm 14000 vịng/phút trong 3 phút. Loại bỏ dịch xuống cột. Thay ống eppendorf mới và lặp lại bước ly tâm thêm 1 phút. - Đặt cột vào ống eppendorf 1,5 ml sạch và loại bỏ ống có chứa dịch. Thêm 200 µl đệm AE hoặc nước sạch. Đặt ở nhiệt độ phịng trong 1 phút, sau đó ly tâm 8000 vịng/phút trong 1 phút.

- Lặp lại bước trên lần thứ hai để thu ADN tổng số.

- ADN tổng số được bảo quản ở -20ºC đến khi sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.

Sự có mặt của ADN tổng số được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8 - 1%, nhuộm bằng ethidium bromide và chụp ảnh dưới ánh sáng tử ngoại. Nồng độ của ADN tổng số được định lượng bằng cách đo mật độ hấp thụ ánh sáng tử ngoại của các acid nucleic ở bước sóng 260 nm (A260) trên máy NanoDrop 2000c. Độ tinh sạch của ADN tách chiết được xác định bằng tỷ số A260/A280 trong khoảng từ

Tách chiết ADN tổng số từ máu

ADN tổng số được tách chiết từ máu sử dụng QIAamp DNA Blood Mini Kit của Qiagen (QIAGEN, Đức). Các bước thực hiện như sau:

- Hút 20 μl QIAGEN Protease cho vào đáy ống eppendorf. Bổ sung 200 µl máu vào ống trên và trộn đều.

- Bổ sung 200 μl đệm AL, trộn đều trong 15 giây. Ủ ở 56C trong 10 phút và ly tâm nhẹ.

- Bổ sung 200 μl Ethanol (96% - 100%), trộn đều trong 15 giây và ly tâm nhẹ. - Chuyển dịch thu được lên cột QIAamp Mini Spin và ly tâm 8000 vòng/phút

trong 1 phút. Loại bỏ dịch xuống cột. Chuyển cột sang ống eppendorf 1,5 ml mới.

- Bổ sung 500 μl đệm AW1 và ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dịch xuống cột. Chuyển cột sang ống eppendorf 1,5 ml mới.

- Bổ sung 500 μl đệm AW2 và ly tâm 14000 vòng/phút trong 3 phút. Loại bỏ dịch xuống cột. Chuyển cột sang ống eppendorf 1,5 ml mới. Ly tâm 14000 vòng/phút trong 1 phút

- Cho cột vào ống eppendorf 1,5 ml mới và bổ sung 200 μl đệm AE hoặc H2O. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút và ly tâm với tốc độ 8000 vòng/phút trong 1 phút để thu ADN tổng số.

Bảo quản ADN tổng số ở -20C cho đến khi sử dụng. Kiểm tra kết quả tách ADN tổng số bằng điện di và định lượng ADN bằng cách đo quang phổ trên máy NanoDrop 2000c tương tự như trên.

2.2.2. Điện di kiểm tra sản phẩm trên gel agarose và polyacrylamide

Gel agarose 1 - 2% được chuẩn bị trong đệm TAE với nồng độ EDTA 1 - 2 mM để tránh sự phân cắt ADN bởi nuclease. Tương tự, gel polyacrylamide 10% được tạo thành với các thành phần gồm: dung dịch acrylamide 30%, TBE 5X, APS 10% và TEMED. Mẫu ADN được trộn với đệm mẫu có chứa glycerol 20%, chất chỉ thị màu bromophenol xanh, xylene cyanol và tra vào các giếng trên gel. Quá trình điện di được thực hiện với hiệu điện thế ổn định là 10 volt cm gel đến khi vạch màu

bromophenol xanh cách mép gel khoảng 2 cm thì dừng lại. Sau khi kết thúc điện di, bản gel được ngâm trong dung dịch nhuộm EtBr trong 15 - 20 phút. Quan sát dưới tia UV và chụp ảnh bằng hệ thống Geldoc (Biorad).

2.2.3. Khuếch đại đoạn gen quan tâm bằng phương pháp PCR

Các cặp mồi đặc hiệu cho từng đoạn gen được thiết kế sử dụng chương trình Primer BLAST với trình tự ADN ty thể được tham khảo từ cơ sở dữ liệu trong NCBI có mã số NC_012920.1. Trình tự của các cặp mồi được sử dụng để nhân bản các đoạn ADN chứa gen quan tâm được trình bày trong Bảng 2.2.