Chương 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.6. Nhân dòng và tách chiết ADN plasmid
Các sản phẩm PCR sau hi đã iểm tra bằng điện di trên gel agarose được tạo đầu bằng và gắn trực tiếp vào vector nhân dòng pJET1.2/blunt Cloning Vector theo kit của Fermentas.
- Thành phần của phản ứng tạo đầu bằng cho sản phẩm PCR được thực hiện trên đá bao gồm: 5 µl đệm phản ứng 2X; 0,5 µl sản phẩm PCR; 0,5 µl enzyme tạo đầu bằng ADN và 3 µl ddH2O trong tổng thể tích 9 µl phản ứng. Trộn đều và ly tâm trong 3 - 5 giây. Ủ hỗn hợp ở 70°C trong 5 phút. Làm lạnh trên đá.
- Bổ sung vào hỗn hợp của phản ứng nối bao gồm: 0,5 µl vector pJET1.2 (50 ng/µl); 0,5 µl T4 ADN Ligase. Trộn đều và ly tâm trong 3 - 5 giây. Ủ hỗn hợp ở nhiệt độ phòng (22°C) trong 5 phút và sử dụng để biến nạp vào E.coli DH5α. Các bước biến nạp vào E.coli DH5α:
- Lấy tế bào khả biến DH5α ra hỏi tủ lạnh -80ºC và để trong đá trong hoảng 30 phút.
- Bổ sung 5 µl sản phẩm ADN đã gắn vào vector và trộn nhẹ. Ủ trên đá trong 30 phút.
- Sốc nhiệt ở 42°C trong 30 giây và chuyển nhanh lại vào đá. Giữ trên đá 2 phút. - Bổ sung 1 ml LB lỏng và ủ ở 37°C, 15 phút và lắc trong 1 giờ ở 37°C.
- 50 - 100 l hỗn hợp biến nạp được cấy trải tế bào trên đĩa petri chứa mơi trường LB đặc có 50 g/ml ampicillin và nuôi trong tủ ấm 37°C đến khi quan sát thấy sự hình thành các khuẩn lạc rõ rệt (qua đêm hoặc sau 12 - 30 giờ nuôi cấy). Nuôi cấy E.coli DH5α:
- Khuẩn lạc trắng thu được sau khi biến nạp được cấy chuyển vào 2 ml môi trường LB lỏng có bổ sung Ampicillin (50 mg/ml), ni lắc 200 v/p từ 12 - 16 giờ ở 37ºC.
Tách chiết ADN plasmid:
ADN plasmid được tách chiết từ dung dịch nuôi cấy sử dụng QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) theo quy trình của nhà sản xuất:
- Bổ sung 250 µl đệm P1 (đã giữ lạnh) vào ống eppendorf có chứa cặn tế bào
E.coli DH5α (đệm P1 đã có Rnase A theo tỉ lệ Rnase A : P1 = 1 : 100 và
LyseBlue theo tỉ lệ LyseBlue : P1 = 1 : 1000 trước khi sử dụng). - Thêm 250 µl đệm P2, trộn đều 4 - 6 lần ( hông để lâu quá 5 phút).
- Bổ sung 350 µl đệm N3 và đảo đều nhanh tay 4 - 6 lần. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút.
- Chuyển dịch nổi sang cột QIAprep spin. Ly tâm 30 - 60 giây. Loại bỏ dịch. Rửa cột bằng cách bổ sung 0,5 ml đệm PB và ly tâm 30 - 60 giây. Loại bỏ dịch. - Thêm 0,75 ml đệm PE và ly tâm 30 - 60 giây. Loại bỏ dịch và ly tâm thêm 1
phút để loại bỏ hồn tồn đệm rửa cịn lại.
- Đặt cột QIAprep vào ống effendorf 1,5 ml. Thêm 5 µl đệm EB (10 mM Tris-Cl, pH 8,5) vào cột, để trong 5 phút và ly tâm trong 1 phút để thu dịch chứa ADN plasmid.
Sản phẩm tách chiết ADN plasmid được kiểm tra trên gel agarose và định lượng bằng đo độ hấp thụ ở bước sóng 260 nm.