Tách chiết ADN tổng số

Chương 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Tách chiết ADN tổng số

Tách chiết ADN tổng số từ mô

ADN tổng số từ mẫu mô được tách chiết bằng QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN, Đức) theo quy trình của nhà sản xuất. Các bước thực hiện như sau: - Mẫu mô được lấy ra từ tủ lạnh -80C, rã đông và rửa bằng đệm phosphate 100

mM, pH 8,0. Cân khoảng 25 mg mẫu mô và cắt thành những mảnh nhỏ đựng trong ống eppendorf.

- Bổ sung 180 µl đệm ATL và 20 µl proteinase K, trộn đều và ủ ở 56ºC trong khoảng 2 giờ đến qua đêm tùy hối lượng mẫu đến khi mẫu mô được thủy phân hồn tồn.

- Thêm 200 µl đệm AL, trộn đều trong 15 giây, ủ ở 70ºC trong 10 phút. - Thêm 200 µl Ethanol 100%, trộn đều trong 15 giây.

- Cho dịch lên cột QIAamp Mini Spin. Ly tâm 8000 vòng phút trong 1 phút. Đặt cột vào ống eppendorf sạch và loại bỏ ống có chứa dịch.

- Bổ sung lên cột 500 µl đệm AW1. Ly tâm 8000 vịng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dịch xuống cột.

- Bổ sung lên cột 500 µl đệm AW2. Ly tâm 14000 vịng/phút trong 3 phút. Loại bỏ dịch xuống cột. Thay ống eppendorf mới và lặp lại bước ly tâm thêm 1 phút. - Đặt cột vào ống eppendorf 1,5 ml sạch và loại bỏ ống có chứa dịch. Thêm 200 µl đệm AE hoặc nước sạch. Đặt ở nhiệt độ phịng trong 1 phút, sau đó ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút.

- Lặp lại bước trên lần thứ hai để thu ADN tổng số.

- ADN tổng số được bảo quản ở -20ºC đến khi sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.

Sự có mặt của ADN tổng số được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8 - 1%, nhuộm bằng ethidium bromide và chụp ảnh dưới ánh sáng tử ngoại. Nồng độ của ADN tổng số được định lượng bằng cách đo mật độ hấp thụ ánh sáng tử ngoại của các acid nucleic ở bước sóng 260 nm (A260) trên máy NanoDrop 2000c. Độ tinh sạch của ADN tách chiết được xác định bằng tỷ số A260/A280 trong khoảng từ

Tách chiết ADN tổng số từ máu

ADN tổng số được tách chiết từ máu sử dụng QIAamp DNA Blood Mini Kit của Qiagen (QIAGEN, Đức). Các bước thực hiện như sau:

- Hút 20 μl QIAGEN Protease cho vào đáy ống eppendorf. Bổ sung 200 µl máu vào ống trên và trộn đều.

- Bổ sung 200 μl đệm AL, trộn đều trong 15 giây. Ủ ở 56C trong 10 phút và ly tâm nhẹ.

- Bổ sung 200 μl Ethanol (96% - 100%), trộn đều trong 15 giây và ly tâm nhẹ. - Chuyển dịch thu được lên cột QIAamp Mini Spin và ly tâm 8000 vòng/phút

trong 1 phút. Loại bỏ dịch xuống cột. Chuyển cột sang ống eppendorf 1,5 ml mới.

- Bổ sung 500 μl đệm AW1 và ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dịch xuống cột. Chuyển cột sang ống eppendorf 1,5 ml mới.

- Bổ sung 500 μl đệm AW2 và ly tâm 14000 vòng/phút trong 3 phút. Loại bỏ dịch xuống cột. Chuyển cột sang ống eppendorf 1,5 ml mới. Ly tâm 14000 vòng/phút trong 1 phút

- Cho cột vào ống eppendorf 1,5 ml mới và bổ sung 200 μl đệm AE hoặc H2O. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút và ly tâm với tốc độ 8000 vòng/phút trong 1 phút để thu ADN tổng số.

Bảo quản ADN tổng số ở -20C cho đến khi sử dụng. Kiểm tra kết quả tách ADN tổng số bằng điện di và định lượng ADN bằng cách đo quang phổ trên máy NanoDrop 2000c tương tự như trên.