Thống kê các biến đổi của gen ATP6 xác định trên 35 mẫu mô u của bệnh nhân ung thư vú và 26 mẫu máu của người bình thường được trình bày cụ thể trong
Bảng 3.11 và Bảng 3.12.
Bảng 3.11. Thống kê biến đổi của gen ATP6 trên mẫu mô u của bệnh nhân ung thư vú
STT Vị trí Biến đổi Thay đổi
axít amin Tần suất Công bố
1 8575 C > T L17L 1/35 +
2 8584 G > A A20T 11/35 +
3 8603 T > C F26S 1/35 +
4 8610 T > C P28P 1/35 +
5 8697 G > A M57M 1/35 Ung thư tuyến giáp 6 8701 A > G T59A 13/35 Ung thư tuyến giáp
7 8772 T > C T82T 1/35 + 8 8784 A > G G86G 1/35 + 9 8829 C > T N101N 1/35 + 10 8860 A > G T112A 35/35 + 11 8866 A > G I114V 1/35 + 12 8868 T > C I114I 1/35 + 13 8896 G > A A124T 2/35 + 14 8972 T > C L149P 1/35 + 15 9000 A > G V158V 1/35 + 16 9053 G > A S176N 8/35 + 17 9055 G > A A177T 1/35 + 18 9076 A > T I184 F 1/35 + 19 9090 T > C S188S 1/35 + 20 9202 A > C T226P 1/35 +
Kết quả cho thấy đã xác định được tổng số 20 biến đổi của gen ATP6 trên mẫu mơ u, trong đó có 9 biến đổi hơng làm thay đổi trình tự axít amin và 11 biến đổi làm thay đổi trình tự axít amin, đã được cơng bố trên MITOMAP. Trong đó, có 2 biến đổi G8697A (1/35 mẫu) và A8701G (13/35 mẫu) đã được công bố trong ung thư tuyến giáp. Ngồi một số biến đổi làm thay đổi trình tự axít amin có tần suất cao là G8584A (11/35 mẫu, 31,43%), A8701G (13/35 mẫu, 37,14%) và G9053A (8/35 mẫu, 22,86%), các biến đổi còn lại được xác định với tần suất 2,86% - 5,71%. Riêng biến đổi A8860G được xác định thấy có mặt trong 100% mẫu giải trình tự. Biến đổi A8860G của gen ATP6 cũng đã được báo cáo trong các nghiên cứu trước đây với tần suất từ 79 - 100% trong ung thư vú [45,72,159] và từ 75 - 100% trong các dạng ung thư hác [14,15,119]. Mặc dù biến đổi này làm thay đổi axít amin từ threonine thành alanine ở vùng protein kém bảo thủ và hông tác động đến cấu trúc của protein, tuy nhiên nó vẫn có thể ảnh hưởng đến các đột biến của ADN nhân và ADN ty thể khác và có thể làm tăng nguy cơ mắc ung thư vú [72]. Tương tự, biến đổi đa hình G9055A, làm thay đổi axít amin alanine thành threonine ở vùng protein bảo thủ và có thể ảnh hưởng đến cấu trúc của phân tử protein, đã được báo cáo với tần suất từ 10,5 - 18,6% và có thể làm tăng nguy cơ mắc cũng như tiến triển của ung thư vú [20, 72].
Bảng 3.12. Thống kê biến đổi của gen ATP6 trên mẫu máu của người bình thường
STT Vị trí Biến đổi Thay đổi
axít amin Tần suất Cơng bố
1 8584 G > A A20T 1/26 + 2 8701 A > G T59A 11/26 + 3 8718 A > G K64K 1/26 + 4 8835 C > T A103A 2/26 + 5 8853 A > G W109W 1/26 + 6 8860 A > G T112A 26/26 + 7 8922 C > T G132G 1/26 + 8 9053 G > A S176N 2/26 + 9 9055 G > A A177T 1/26 + 10 9123 G > A L199L 1/26 + 11 9127 A > G I201V 1/26 + 12 9165 T > C V213V 1/26 + 13 9183 InsC 1/26 -
Kết quả xác định trình tự của gen ATP6 trên mẫu máu đối chứng đã xác định được tổng số 13 biến đổi, trong đó có 12 biến đổi đã được công bố và 1 biến đổi mới (9183insC) chưa thấy được công bố trên cơ sở dữ liệu MITOMAP. Trong số 13 biến đổi, có 6 biến đổi làm thay đổi trình tự axít amin và 6 biến đổi khơng làm thay đổi trình tự axít amin (Bảng 3.12). Trong đó, những biến đổi có tần suất cao nhất ở mẫu máu đối chứng là G8860A (100%, 26/26 mẫu) và A8701G (42,31%, 11/26 mẫu). Đặc biệt, có 5 biến đổi G8584A, A8701G, A8860G, G9053A và G9055A được thấy xuất hiện ở cả mẫu mô của bệnh nhân và mẫu máu đối chứng. Các biến đổi này đều ở trạng thái đồng tế bào chất.
Kết quả này cho thấy biến đổi của gen ATP6 trên mẫu máu đối chứng có tần suất thấp hơn so với biến đổi được tìm thấy trong mẫu mơ của bệnh nhân (ngoại trừ các biến đổi G8860A và A8701G). Bên cạnh đó, ngồi các đột biến của ADN ty thể tác động trực tiếp đến phân tử protein, sự có mặt của các đa hình ADN ty thể cũng được cho là đóng vai trị quan trọng vì chúng gây ra một sự gia tăng nhẹ, gần như không thể phát hiện được, trong sản xuất ROS và có thể tạo ra ưu thế chọn lọc đối với các ADN đột biến [75]. Giải thích cho điều này, Maximo và cs (2002) cho rằng các đa hình của gen ATP6 có thể dẫn đến sự sao chép ADN ty thể kém hiệu quả và có liên quan với sự xuất hiện của các bất thường của ADN ty thể như mất đoạn lớn của ADN ty thể và sự hình thành của khối u [116]. Từ kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi đã tiến hành lựa chọn biến đổi G9053A là biến đổi làm thay đổi trình tự axít amin của phân tử protein, có tần suất cao trên mẫu mơ u của bệnh nhân và tần suất thấp trên mẫu máu của người bình thường để thực hiện sàng lọc trên các mẫu nghiên cứu bằng phương pháp PCR-RFLP.
Nhằm xác định biến đổi G9053A của gen ATP6 bằng phương pháp PCR-
RFLP, chúng tôi tiến hành thiết kế cặp mồi có sự biến đổi nucleotide để nhân bản đặc hiệu đoạn ADN của gen ATP6 có chứa biến đổi G9053A phù hợp cho cắt
bằng enzyme giới hạn. Trình tự cặp mồi 9053 F - R và các điều kiện cho phản ứng PCR được trình bày cụ thể trong Bảng 2.2 và Bảng 2.3. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 2,5%, nhuộm bằng EtBr và quan sát trên máy soi gel.
Kết quả điện di trên Hình 3.13 cho thấy đã thu được băng sản phẩm PCR sáng, rõ nét, không xuất hiện băng phụ, ích thước sản phẩm bằng 298 bp đúng với tính tốn ban đầu.
Sản phẩm PCR được cắt bằng enzyme giới hạn Hin6I có vị trí nhận biết 5’
G↓CGC 3’ để xác định biến đổi tại vị trí 9053 của gen ATP6.
- Nếu hơng có biến đổi (9053G) thì enzyme Hin6I sẽ cắt sản phẩm PCR có
ích thước 298 bp thành 2 đoạn ADN có ích thước 252 bp và 46 bp.
- Nếu có biến đổi (9053A) thì enzyme Hin6I sẽ hơng cắt và tạo thành 1 băng duy nhất có ích thước bằng sản phẩm PCR (298 bp).
Sản phẩm thu được sau khi cắt enzyme được điện di kiểm tra trên gel agarose 2,5%, nhuộm bằng EtBr và quan sát trên máy soi gel. Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng Hin6I được thể hiện ở Hình 3.13.
Hình 3.13. Ảnh điện di sản phẩm PCR và sản phẩm cắt bằng enzyme Hin6I trên gel agarose 2,5%
M: Thang chuẩn ADN 50 bp. Giếng 1, 3: sản phẩm PCR mẫu mô u của bệnh nhân # 48839 và # 50264. Giếng 2, 4: Sản phẩm cắt mẫu mô u của bệnh nhân # 48839 và # 50264.
Kết quả cho thấy: tại giếng 2 xuất hiện 2 băng có ích thước 241 bp và 57 bp, giếng 4 xuất hiện 3 băng có ích thước 195 bp, 57 bp và 46 bp. Kết quả này khác so với tính tốn ban đầu của chúng tôi. Kiểm tra lại trên các mẫu đã giải trình tự cho thấy 100% các mẫu của bệnh nhân và đối chứng đều có biến đổi A8860G. Biến đổi từ A > G tại vị trí 8860 tạo ra 1 điểm cắt của enzyme Hin6I làm cho các mẫu khơng có biến đổi G9053A được cắt tại 2 vị trí và tạo ra 3 băng có ích thước là 195 bp, 57 bp và 46 bp. Tương tự, với các mẫu có đồng thời 2 biến đổi G9053A
và A8860G thì enzyme Hin6I sẽ cắt tại 1 vị trí và tạo thành 2 băng có ích thước
241 bp và 57 bp. Kết quả này cho thấy ở giếng số 2 là mẫu có biến đổi G9053A và giếng số 4 là mẫu khơng có biến đổi. Kết quả này chứng tỏ chúng tôi đã thực hiện thành công phản ứng PCR-RFLP để phát hiện đột biến G9053A của gen ATP6.
Thực hiện sàng lọc trên các mẫu nghiên cứu cho thấy có sự khác biệt về tỉ lệ biến đổi G9053A trong các mẫu nghiên cứu, trong đó, tỉ lệ dạng biến đổi 9053A là 21,6% (22 102 trường hợp) ở mô u và mô liền kề và 18,5% (12 65 trường hợp) ở mẫu máu của người khỏe mạnh bình thường. Tuy nhiên, sự khác biệt này khơng có ý nghĩa thống kê với p = 0,627 (Hình 3.14).