Chương 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.7. Định lượng ADN bằng real-time PCR
Để định lượng số bản sao và mất đoạn lớn trong ADN ty thể bằng phương pháp real-time PCR, đoạn ADN của gen HBB (hemoglobin subunit beta) nằm trên
vai ngắn của nhiễm sắc thể 11 được chọn đại diện cho ADN nhân, gen ND1 nằm
trong vùng ít xảy ra mất đoạn và gen ND4 nằm trong vùng hay xảy ra mất đoạn
được chọn đại diện cho ADN ty thể [81, 83]. Các cặp mồi đặc hiệu cho gen HBB,
ND1 và ND4 được thiết kế dựa vào trình tự chuẩn của ADN ty thể (mã số NC_012920.1) và gen HBB (mã số NG_000007.3) trên NCBI. Trình tự của các cặp
mồi sử dụng trong real-time PCR được trình bày trong Bảng 2.5.
Bảng 2.5. Trình tự các cặp mồi sử dụng trong phản ứng real-time PCR
Gen đích Tên mồi Kích thước (Vị trí) Trình tự mồi xi (5’ - 3’) Trình tự mồi ngược (5’ - 3’) HBB HBB 104 bp (70615-70718) ggagaagtctgccgttactg ccttaaacctgtcttgtaacct ND1 ND1-2 115 bp (3775-3889) agtggctcctttaacctctc ggttggtctctgctagtgtg ND4 ND4 128 bp (10903-11030) cctatttagctgttccccaa gtgatagtggttcactggataagt
2.2.7.1. Xây dựng đường chuẩn đối với các mẫu ADN plasmid chứa các đoạn chèn của gen HBB, ND1 và ND4
Plasmid mang đoạn ADN của gen HBB, ND1 và ND4 được tách chiết, tinh
sạch và định lượng bằng cách đo mật độ hấp thụ ánh sáng tử ngoại của các acid nucleic ở bước sóng 260 nm (A260) trên máy NanoDrop 2000c. Số bản sao ADN plasmid ban đầu được tính tốn dựa trên ích thước, trọng lượng phân tử và nồng độ của ADN plasmid theo công thức sau [104]:
SBS = C x 6,02 x 10
23
L x 660 x 109
Trong đó: SBS: Số bản sao ADN plasmid C: Nồng độ plasmid (ng/µl)
Dung dịch ADN plasmid chứa các đoạn ADN của gen HBB, ND1 và ND4
được pha loãng với hệ số 10 (từ 109 đến 101 bản sao/µl) để xây dựng đường chuẩn và xác định giới hạn phát hiện của phản ứng cho phương pháp định lượng real-time PCR (Bảng 2.6). Tiến hành chạy lặp lại trong 3 ngày, mỗi ngày chạy 3 lần, mỗi lần chạy 3 phản ứng. Hiệu suất khuếch đại của phản ứng real-time PCR được xác định dựa vào đường chuẩn theo công thức [144]:
E= (10-1/a - 1) x 100%
Trong đó: E: hiệu suất phản ứng (%)
a: là hệ số góc của đường chuẩn định lượng.
Bảng 2.6. Bảng pha loãng nồng độ plasmid theo hệ số 10
STT Thể tích plasmid (µl) Thể tích H2O (µl) Nồng độ cuối (số bản sao/µl) 1 100 µl của 2 x 109 900 2 x 108 2 100 µl của 2 x 108 900 2 x 107 3 100 µl của 2 x 107 900 2 x 106 4 100 µl của 2 x 106 900 2 x 105 5 100 µl của 2 x 105 900 2 x 104 6 100 µl của 2 x 104 900 2 x 103 7 100 µl của 2 x 103 900 2 x 102 8 100 µl của 2 x 102 900 2 x 101
2.2.7.2. Xác định số bản sao ADN ty thể và mức độ mất đoạn trong mẫu
Các mẫu nghiên cứu được khuếch đại nhờ phản ứng real-time PCR với thành phần bao gồm: 5 l qPCR BIO SyGreen Mix Lo-ROX; 1 l mồi xi (0,04 µM); 1
l mồi ngược (0,04 µM); 15 ng ADN tổng số và H2O trong tổng thể tích 10 l phản
ứng. Hỗn hợp phản ứng được trộn đều và chạy trên máy MyGo Pro Real-time PCR (IT-IS Life Science Ltd) với chu trình nhiệt được cài đặt như Bảng 2.7.
Cường độ tín hiệu huỳnh quang được ghi nhận trong 1 giây sau khi kết thúc một chu kỳ và được phân tích bởi phần mềm của máy MyGo Pro Real-time PCR. Sau khi hoàn tất các chu kỳ nhiệt sẽ thu được các giá trị chu kỳ ngưỡng (Ct) của
vượt khỏi tín hiệu nền (baseline - là số chu kỳ của phản ứng PCR mà tín hiệu huỳnh quang đặc hiệu tích lũy dần nhưng chưa đạt ngưỡng nhận biết của thiết bị).
Bảng 2.7. Chu trình nhiệt của phản ứng real-time PCR
Số chu kỳ Nhiệt độ Thời gian Ghi chú
1 95°C 120 giây Hoạt hóa enzyme
40
95°C 10 giây Biến tính
60°C 30 giây Gắn mồi, kéo dài chuỗi
Dựa trên các giá trị Ct của mẫu nghiên cứu, số bản sao của ADN ty thể được tính tốn dựa trên hiệu số ∆Ct giữa Ct của ADN nhân (gen HBB) và ADN ty thể (gen ND1). Số bản sao tương đối của ADN ty thể được xác định dựa theo công thức sau [60, 94, 181]:
SBS = 2∆Ct
Trong đó: SBS: Số bản sao tương đối của ADN ty thể ∆Ct = Ct HBB - Ct ND1
Tỉ số số bản sao mô u/mô liền kề (T N ratio) được xác định bằng tỉ số giữa số bản sao của ADN ty thể ở mô u và số bản sao của ADN ty thể ở mô liền kề của cùng bệnh nhân. Tỉ số T N > 1 có nghĩa là số bản sao của ADN ty thể tăng ở mô u so với mô liền kề. Ngược lại, T N < 1 có nghĩa là số bản sao của ADN ty thể giảm ở mô u so với mô liền kề tương ứng [22].
Công thức xác định mức độ mất đoạn của ADN ty thể được tính tốn dựa trên tỉ lệ số bản sao của gen ND4 và ND1 trong mẫu nghiên cứu (RND4/ND1). Giá trị R chính là tỷ lệ số bản sao khơng bị mất đoạn của ADN ty thể [81].
RND4/ND1 = 2∆Ct
Trong đó: RND4/ND1: Tỉ lệ số bản sao của gen ND4 và ND1 ∆Ct = Ct ND1 - Ct ND4
Do số bản sao của gen ND1 đại diện cho tổng số bản sao của ADN ty thể cho nên mức độ mất đoạn của ADN ty thể được xác định bằng công thức [21]:
D = (1 - RND4/ND1) x 100%
Trong đó: D là mức độ mất đoạn của ADN ty thể trong mẫu nghiên cứu.