Thống kê về biến đổi của các gen tARN ty thể ở mẫu mô u của bệnh nhân ung thư vú được xác định bằng giải trình tự được trình bày cụ thể trong Bảng 3.14.
Bảng 3.14. Thống kê biến đổi của gen tARN ty thể trên mẫu mô của bệnh nhân ung thư vú
Gen Biến đổi Loại mô Trạng thái Tần suất Công bố
MT-TI A4316G Mô u Đồng tế bào chất 1/49 (+) Khiếm thính
MT-TQ A4385T Mô u Đồng tế bào chất 2/49 (+)
MT-TW A5536T Mô liền kề Dị tế bào chất 1/49 (-)
MT-TA T5587C Mô u Đồng tế bào chất 1/49 (+) DEAF
G5591A Mô u Đồng tế bào chất 1/49 (+) Myopathy T5628C Mô u &
mô liền kề
Đồng tế bào chất 2/49 (+) CPEO /DEAF G5645T Mô u Đồng tế bào chất 1/49 (-)
G5650A Mô u Dị tế bào chất 1/49 (+) Myopathy
MT-TN A5724G Mô u Đồng tế bào chất 1/49 (-)
MT-TC G5773A Mô u Đồng tế bào chất 1/49 (+)
G5821A Mô u Đồng tế bào chất 2/49 (+) DEAF
MT-TY A5836G Mô u Đồng tế bào chất 1/49 (+)
(+): Đã công bố trên MITOMAP. (-): Chưa công bố trên MITOMAP
Trong các nghiên cứu trước đây, tỉ lệ biến đổi của gen tARN cũng được phát hiện thấy khác nhau trên các nhóm bệnh nhân ung thư vú khác nhau. Nghiên cứu của Parrella và cs (2001) và Tan và cs (2002) không phát hiện thấy biến đổi của gen tARN trên 18 và 19 bệnh nhân tương ứng [135, 159]. Ngược lại, nghiên cứu của Zhu và cs (2005), Fendt và cs (2011) và Tseng và cs (2011) phát hiện được 2 biến đổi của gen tARN (chiếm 4,4%, 10% và 5% tương ứng) trong các bệnh nhân nghiên cứu [187, 63, 165]. Trên bệnh nhân ung thư vú ở Ba Lan, Grzybowska-Szatkowska và cs (2012) phát hiện thấy 8 biến đổi đa hình và 2 đột biến của gen tARN với tỷ lệ 34% (17/50 bệnh nhân) [73]. Trong nghiên cứu này, kết quả cho thấy đã xác định được tổng số 12 biến đổi của các gen tARN trong tổng số 49 mẫu giải trình tự. Đáng chú ý, các biến đổi này chưa được báo cáo trước đây trên các nhóm bệnh nhân ung thư vú được nghiên cứu. Bên cạnh đó, trong khi hầu hết các biến đổi tập trung trên gen MT-TA (mã hóa cho tARNAla) (41,67%, 5/12 biến đổi), các biến đổi còn lại
A4385T, T5628C và G5821A của gen MT-TQ, MT-TA và MT-TC tương ứng được
tìm thấy trong 4,08% bệnh nhân (2 49 trường hợp) trong khi các biến đổi khác thấy xuất hiện trong 2,04% bệnh nhân (1 49 trường hợp). Một số biến đổi như A4316G của gen MT-TI, T5587C, G5591A, T5628C và G5650A của gen MT-TA và G5821A của gen MT-TC được công bố trước đây có liên quan với bệnh khiếm thính (hearing loss) và bệnh cơ (myopathy). Đáng chú ý là có 3 biến đổi gồm A5536T (thuộc gen
MT-TW), G5645T (thuộc gen MT-TA) và A5724G (thuộc gen MT-TN) chưa được
công bố trên cơ sở dữ liệu MITOMAP. Đây có thể là các biến đổi mới của gen tARN ty thể trên đối tượng bệnh nhân ung thư vú người Việt Nam. Mặt khác, các biến đổi này được phát hiện với tần suất thấp, do đó các biến đổi này có thể là các biến đổi hiếm trong nhóm bệnh nhân này.
Trong hầu hết các trường hợp, biến đổi của gen tARN là biến đổi đồng tế bào chất và phát hiện thấy trong mẫu mô u của bệnh nhân. Trường hợp biến đổi dị tế bào chất được phát hiện thấy trong 16,7% (2/12) các biến đổi được tìm thấy ở cả mơ u và mô liền kề của bệnh nhân. Kết quả giải trình tự trực tiếp cũng chỉ ra rằng các biến đổi này (A5536T và G5650A) có mức độ dị tế bào chất khác nhau (Hình 3.16). Đáng chú ý, kết quả cũng cho thấy hầu hết các biến đổi xảy ra ở các bệnh nhân ở giai đoạn I của bệnh, chiếm khoảng 70% (7 10 trường hợp) so với các bệnh nhân ở giai đoạn II (10%) và giai đoạn III (20%). Phân tích mức độ biệt hóa mơ cho thấy các biến đổi của gen tARN được tìm thấy chủ yếu tập trung vào giai đoạn biệt hóa vừa của khối u, chiếm 88,9% (8 9 trường hợp). Tuy nhiên, chúng tơi khơng tìm thấy có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về tần suất của các biến đổi này theo độ tuổi, ích thước khối u, số hạch, ích thước hạch, mức độ xâm lấn (giai đoạn T), mức độ hạch (giai đoạn N), mức độ biệt hóa và giai đoạn bệnh (dữ liệu hơng được báo cáo).
3.5.2. Dự đoán sự thay đổi cấu trúc bậc 2 của phân tử tARN có biến đổi
Để nghiên cứu sâu hơn tác động của các biến đổi mới chưa được công bố (A5536T, G5645T và A5724G) lên cấu trúc bậc 2 của phân tử tARN, chúng tôi sử dụng chương trình dự đốn cấu trúc bậc 2 RNAfold WebServer. Sự tác động của các biến đổi này lên cấu trúc bậc 2 của các phân tử tARN tương ứng được thể hiện trong Hình 3.17.
A. MFE: -9,60 kcal/mol MFE: -10,00 kcal/mol
B. MFE: -4,90 kcal/mol MFE: -4,70 kcal/mol
C. MFE: -9,60 kcal/mol MFE: -9,60 kcal/mol
Hình 3.17. Dự đốn sự thay đổi cấu trúc của các phân tử tARN khi có biến đổi A5536T, G5645T và A5724G
MFE (minimum free energy): năng lượng tự do tối thiểu
Theo đó, chỉ có 2 biến đổi A5536T và G5645T làm thay đổi cấu trúc bậc 2 của phân tử tARNTrp và tARNAla, trong hi đó biến đổi A5724G không làm ảnh hưởng đến cấu trúc của phân tử tARNAsn
A5536T làm giảm năng lượng tự do tối thiểu (MFE) đối với phân tử tARNTrp, điều này cho thấy rằng biến đổi A5536T có thể đóng một vai trị quan trọng trong cấu trúc bậc 2 của phân tử và có thể có vai trị trong q trình phát sinh bệnh.
Nghiên cứu của Stewart và cs (2015) trên 527 mẫu mô u của 14 dạng ung thư hác nhau đã xác định được 15 đột biến soma của ADN ty thể xảy ra chủ yếu ở các gen tARN và có liên quan với sự tích lũy của các phân tử tiền thân tARN chưa trưởng thành, cho thấy các phân tử tARN khiếm khuyết được trưởng thành trong bệnh ung thư. Hiện tượng này được giải thích là do cấu trúc bậc 2 của phân tử tARN bị thay đổi, điều này chứng minh rằng quá trình cuộn gập của tARN chính xác là một yếu tố quyết định chính cho q trình chế biến các bản sao polycistronic của tARN ty thể. Bên cạnh đó, nghiên cứu này cũng chỉ ra rằng có một áp lực chọn lọc loại bỏ các đột biến mã hóa có hại và cho rằng chức năng của ty thể là cần thiết trong các tế bào ung thư [155].
3.5.3. Sàng lọc biến đổi A5536T trên các mẫu nghiên cứu
Để nghiên cứu biến đổi A5536T của gen MT-TW, chúng tôi tiến hành nhân bản đoạn ADN chứa vị trí 5536 của gen MT-TW. Sản phẩm PCR được thể hiện ở
Hình 3.18.
Hình 3.18. Ảnh điện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi TW-3 trên gel agarose 1,7%
M: Thang chuẩn ADN 50 bp. T: Mẫu mô liền kề. B: Mẫu mô u. ĐC (-): Đối chứng âm (H2O)
Kết quả điện di cho thấy đã thu được các băng có ích thước 173 bp theo đúng tính tốn lý thuyết. Các băng sáng, rõ nét, hông xuất hiện băng phụ hoặc vệt sáng kéo dài. Điều này chứng tỏ đã thu được sản phẩm PCR đặc hiệu và đủ điều
kiện cho phân tích RFLP. Sản phẩm PCR được cắt bằng enzyme giới hạn FspBI có vị trí nhận biết 5’ C↓TAG 3’ để xác định biến đổi tại vị trí 5536 của gen MT-TW.
- Nếu hơng có biến đổi (5536A) thì enzyme FspBI sẽ khơng cắt sản phẩm
PCR và tạo thành 1 băng duy nhất có ích thước 173 bp.
- Nếu có biến đổi (5536T) thì enzyme FspBI cắt sản phẩm PCR tại 1 điểm và tạo thành 2 băng ADN có ích thước 108 bp và 65 bp.
Sản phẩm thu được sau khi cắt enzyme được điện di kiểm tra trên gel polyacrylamide 8% và nhuộm bằng EtBr (Hình 3.19). Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng enzyme FspBI cho thấy: tại giếng số 2 xuất hiện 3 băng có ích thước 173 bp, 108 bp và 65 bp, chứng tỏ mẫu này có chứa biến đổi A5536T dạng dị tế bào chất. Tuy nhiên, kết quả sàng lọc trên 102 bệnh nhân chỉ phát hiện được 1 trường hợp duy nhất có biến đổi A5536T ở bệnh nhân # 26137. Kết quả này cũng đã được khẳng định thơng qua giải trình tự.
Hình 3.19. Ảnh điện di sản phẩm cắt bằng enzyme FspBI trên gel polyacrylamide 8%
M: Thang chuẩn ADN 50 bp. Giếng 1: Sản phẩm PCR. Giếng 2: Sản phẩm cắt bằng enzyme FspBI (# 26137).
Trong những năm gần đây, biến đổi của gen tARN ty thể đã được báo cáo trong nhiều dạng ung thư khác nhau bởi vì các biến đổi này được cho là nguyên nhân gây nhiều bệnh ở người [182]. Biến đổi của gen tARN ty thể tác động đến cấu trúc bậc 2 của phân tử và tác động đến quá trình dịch mã, từ đó dẫn đến sai hỏng chức năng của chuỗi hô hấp ty thể và làm thay đổi các quá trình sinh học liên quan đến tiến triển của ung thư [12]. Các biến đổi mới gây bệnh đã được phát hiện thấy ở
tARNLeu(CUN)) ở ung thư đại trực tràng [126], ung thư miệng [54], ung thư tuyến tiền liệt và ung thư thận [25]; biến đổi A12307G (của gen mã hóa tARNLeu(CUN)) ở ung thư tụy [99]; A5563G, A7460G và A12172G (của gen mã hóa tARNTrp, tARNSer và tARNHis) ở ung thư phổi [88]; A15924G và A12308G (của gen mã hóa tARNThr và
tARNLeu(CUN)) ở ung thư vú [73].
Trong nghiên cứu này, trong số 3 biến đổi mới được tìm thấy, chỉ có 2 biến đổi A5536T và G5645T làm thay đổi cấu trúc bậc 2 của phân tử tARNTrp
và tARNAla tương ứng. Dạng biến đổi này có thể có vai trị tương tự như đột biến A12172G của gen mã hóa cho tARNHis và C5545T của gen mã hóa cho tARNTrp đã được báo cáo trước đây [145, 169]. Đặc biệt, biến đổi ở dạng dị tế bào chất A5536T có thể có khả năng gây bệnh bởi nó làm thay đổi rõ rệt cấu trúc bậc 2 của phân tử tARNTrp.
3.6. PHÂN TÍCH BIẾN ĐỔI A10398G CỦA GEN ND3
Để nghiên cứu biến đổi A10398G của gen ND3, chúng tôi tiến hành thiết kế cặp mồi 10398 F - R để nhân bản đoạn ADN chứa vị trí 10398 của gen ND3. Trình tự của cặp mồi và điều kiện phản ứng PCR được trình bày cụ thể trong Bảng 2.2 và
Bảng 2.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR được thể hiện trên Hình 3.20.
Hình 3.20. Ảnh điện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi 10398 F - R trên gel agarose 1,5%
M: Thang chuẩn ADN 100 bp. 1, 3, 5: Sản phẩm PCR của mẫu mô liền kề.
Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy tất cả các giếng đều thu được sản phẩm PCR có ích thước khoảng 246 bp. Các băng sáng, rõ nét và hông xuất hiện băng phụ chứng tỏ khơng có hiện tượng bắt cặp hơng đặc hiệu. Kích thước băng phù hợp với các tính tốn lý thuyết ban đầu. Sản phẩm PCR tiếp tục được cắt bằng enzyme giới hạn DdeI có trình tự nhận biết 5’ C↓TNAG 3’ để xác định biến đổi tại vị trí 10398 của gen ND3.
- Nếu hơng có biến đổi (10398A) thì enzyme DdeI sẽ cắt sản phẩm PCR có
ích thước 246 bp tại 1 điểm và tạo thành 2 băng ADN có ích thước 196 bp và 50 bp.
- Nếu có biến đổi (10398G) thì enzyme DdeI sẽ cắt sản phẩm PCR có ích
thước 246 bp thành 3 đoạn ADN có ích thước là 38 bp, 50 bp và 158 bp. Sản phẩm thu được sau khi cắt enzyme được điện di kiểm tra trên gel polyacrylamide 8%, nhuộm EtBr. Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng DdeI được thể hiện ở Hình 3.21. Kết quả cho thấy: tại giếng số 2 xuất hiện 2 băng có ích thước 196 bp và 50 bp, chứng tỏ mẫu này có dạng 10398A. Trong hi đó, giếng số 4 xuất hiện 3 băng có ích thước 158 bp, 50 bp và 38 bp, chứng tỏ mẫu này có dạng 10398G. Đặc biệt, giếng số 6 và 8 xuất hiện cả 4 băng có ích thước 196 bp, 158 bp, 50 bp và 38 bp. Như vậy có thể ở các mẫu này đã xảy ra hiện tượng dị tế bào chất, tức là có cả 2 dạng biến đổi 10398A và 10398G. Tuy nhiên, hiện tượng này chỉ được phát hiện thấy trong 3/102 mẫu nghiên cứu.
Hình 3.21. Ảnh điện di sản phẩm PCR được cắt bằng enzyme DdeI trên gel polyacrylamide 8%
M: Thang chuẩn ADN 100 bp. Giếng 1, 3, 5, 7: Sản phẩm PCR. Giếng 2, 4, 6, 8: Sản phẩm cắt bằng enzyme DdeI
Bên cạnh đó, sản phẩm PCR cũng được tinh sạch và giải trình tự trực tiếp nhằm khẳng định độ chính xác của kết quả PCR-RFLP. Kết quả phân tích trình tự được thể hiện trong Hình 3.22.