Hình 15 : Mức độ tương đồng về acid amin
3.1.1 Tần suất xuất hiện các gen đơn
Kết quả thống kê dựa trên xác định đồng thời sự có mặt của 4 gen đích bao gồm: OXA-23, OXA-51, VIM và IMP trong 100 mẫu DNA tinh sạch từ các mẫu bệnh phẩm dương tính với A. baumannii thu tại Bệnh viện Phổi Trung ương.
Quy trình PCR đã được tối ưu hóa các thành phần tham gia phản ứng cho phép khuếch đại đặc hiệu cả bốn gen đích thể hiện rõ bằng hình ảnh 4 băng rõ nét ở đúng các vị trí mong muốn với kích thước dự kiến trong mẫu mang cả 4 gen (Hình 8).
Hình 8: Kết quả của phản ứng multiplex PCR
(M: Marker 100bp; (-): Đối chứng âm; 1,2,3,4: Các mẫu DNA)
Thống kê kết quả PCR của 100 mẫu cho thấy sự chiếm ưu thế của các beta- lactamase thuộc phân lớp D với OXA-51 là 88 % và OXA-23 là 77 %. Trong khi các gen thuộc phân lớp B lại xuất hiện với tần suất khá thấp 5 % đối với IMP và chỉ có duy nhất một mẫu xuất hiện VIM chiếm tỷ lệ 1 % (Hình 9).
Hình 9: Biểu đồ tỷ lệ phần trăm của các gen nghiên cứu
Kết quả này cũng trùng khớp với các nghiên cứu trong và ngoài nước khác khi tỷ lệ của các gen OXA thường chiếm ưu thế, đặc biệt là OXA-51. (Bảng 6)
Bảng 6: Thống kê tần suất xuất hiện gen OXA-51 trên thế giới và Việt Nam
Địa điểm nghiên cứu Năm công bố Tỷ lệ xuất hiện gen
OXA-51 (%) Tài liệu tham khảo Trên thế giới Ba Lan 2012 63,9 [41] Thổ Nhĩ Kỳ 2006 77,8 [51] 2015 100 [3] Malaysia 2015 97,0 [10] Iran 2013 100 [36] Pakistan 2014 100 [23] Trung Quốc 2015 92,3 [31] 2015 48,4 [25]
Tại Việt Nam
Bệnh Viện Trung Ương Huế 2017 100 [63]
Bệnh viện Đại học Y Dược Huế 2017 100 [63]
Bệnh viện Phổi Trung Ương * 2019 88,0
*: Kết quả của nghiên cứu này.
88%
77%
5%
1%
Kết quả cho thấy các nghiên cứu tại châu Âu cho tỷ lệ xuất hiện của gen OXA-
51 là trên 60 % còn các nghiên cứu tại châu Á cho thấy tỷ lệ đã lên tới hơn 90 % ngoại trừ nghiên cứu tại Trung Quốc của Hou và Yang [25]. Tỷ lệ OXA-51 cao có thể giải thích bằng chính vị trí của gen trong nhiễm sắc thể của A. baumannii, đây là gen tự nhiên sẵn có của A. baumannii, chúng được tìm thấy ngay trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn này và được phân lập lần đầu tiên vào năm 1996 tại Argentina. Chính vì bản chất là gen tự nhiên nên một số nghiên cứu thậm chí đã sử dụng OXA-51 như một gen dùng để định danh A. baumannii [50]. Tuy nhiên theo những số liệu đã nêu ở trên tỷ lệ xuất hiện OXA-51 khơng hồn tồn đồng nhất ở các nghiên cứu và khoảng chênh lệch giữa các nghiên cứu có thể lên tới hơn 40 %, đặc biệt trong nghiên cứu Hou và Yang tần suất phát hiện của gen OXA-51 chỉ là 48,4 % [25].
Mặc dù vậy, kết quả trên cũng không mâu thuẫn với bản chất gen tự nhiên của
OXA-51 mà được giải thích bằng tính đa hình của gen. Số lượng lớn các biến thể của OXA-51 đã làm cho OXA-51 trở thành một họ gen với nhiều gen biến thể khác nhau.
Sự hình thành các biến thể này là do áp lực của quá trình chọn lọc tự nhiên, xuất phát từ việc lựa chọn và sử dụng kháng sinh khác nhau ở các bệnh viện khác nhau trong một nước, trong các khu vực địa lý và trên thế giới. Các nghiên cứu tại Việt Nam cũng đã góp phần chứng minh điều này. Số liệu của nghiên cứu này được thống kê trên 100 mẫu thu thập tại Bệnh viện Phổi Trung Ương chỉ cho tần suất xuất hiện của
OXA-51 là 88 %, tuy nhiên nghiên cứu của Lê Nữ Xuân Thanh và cộng sự tại hai
bệnh viện Trung Ương Huế và bệnh viện Đại học Y Dược Huế trên 90 mẫu thu thập được phát hiện 100 % gen OXA-51 trong các mẫu [63].
Theo kết quả đề tài thu được, bên cạnh sự chiếm ưu thế của OXA-51, một gen khác trong phân lớp D là OXA-23 cũng cho thấy tần suất xuất hiện cao (77%). Tuy nhiên, trái với OXA-51 là gen tự nhiên nằm trên nhiễm sắc thể của A. baumannii, OXA-23 được định vị trên plasmid, chính vì vậy gen này có khả năng chuyển ngang
giữa các chủng vi khuẩn khác nhau. OXA-23 được tìm thấy ở nhiều lồi Acinetobacter và ở cả các vi khuẩn trong họ Enterobacteriaceae [52].
Nếu như dược động học của enzyme mã hóa với OXA-51 có tính chất thủy phân yếu đối với các carbapenem thì dược động học của enzyme do OXA-23 mã hóa
lại tương đối cao. Sản phẩm mã hóa bởi một mình gen OXA-23 của A. baumannii là đủ để tạo ra sự đề kháng với carbapenem. Một nghiên cứu của Claire và cộng sự (2005) đã cho thấy rằng, khi một vector plasmid có số lượng bản sao thấp mang gen
OXA-23 được sao chép vào một chủng A. baumannii, MIC của các carbapenem tăng
từ 0,25 lên 16 µg/ml, điểm dừng để xem xét các chủng kháng thuốc [24]. Còn khi một chủng mang gen OXA-23 đồng thời kết hợp với sự biểu hiện bơm đẩy thuốc AdeABC, MIC được tăng lên lớn hơn 32 µg/ml. Điều này chỉ ra rằng, khơng giống
như một số carbapenemase khác thuộc nhóm OXA, các chủng mang gen OXA-23
khơng yêu cầu hoạt động phối hợp các cơ chế kháng thuốc khác để kháng carbapenem, mặc dù mức độ kháng thuốc cao hơn được khi có các cơ chế khác tham gia. Cũng như các nghiên cứu đối với OXA-51, các nghiên cứu xác định sự có mặt của OXA-23 trên thế giới và Việt Nam cũng cho tỷ lệ cao trên 50 %. Đặc biệt nhiều nghiên cứu ở châu Á đã cho tỷ lệ lên tới 100 %. (Bảng 7)
Bảng 7: Thống kê tần suất xuất hiện gen OXA-23 trên thế giới và Việt Nam
Địa điểm nghiên cứu Năm công bố Tỷ lệ xuất hiện gen
OXA-23 (%) Tài liệu tham khảo Trên thế giới Brazil 2016 51,2 [39] Serbi 2015 57,1 [40] Qatar 2016 100 [47] Ấn Độ 2013 100 [1] Nepal 2017 100 [27]
Tại Việt Nam
Bệnh Viện Trung Ương Huế 2017 100 [63]
Bệnh viện Đại học Y Dược Huế 2017 100 [63]
Bệnh viện Việt Đức và Bệnh viện
Trung Ương Quan đội 108 2018 45,0 [71]
Bệnh viện Phổi Trung Ương * 2019 77,0
Các nghiên cứu trong nước về OXA-23 cũng cho tỷ lệ xuất hiện cao ở các mức độ khác nhau. Nghiên cứu của chúng tơi tìm thấy 77 % gen OXA-23 trong các mẫu thử nghiệm, trong khi đó Lê Nữ Xuân Thanh và cộng sự lại phát hiện sự có mặt của
OXA-23 tới 85,3 % [63] và gần đây nhất là nghiên cứu của Trần Diệu Linh đưa ra tỷ
lệ lên tới 45 % tìm thấy OXA-23 ở A. baumannii và đây là gen phổ biến nhất trong kết quả của tác giả đối với các vi khuẩn Gram (-) được nghiên cứu [71]. Sự xuất hiện phổ biến và khả năng tạo ra sản phẩm thủy phân mạnh đối với carbapenem đã đưa
OXA-23 trở thành cơ chế chính kháng carbapenem của A. baumannii, đặc biệt là đối
với khu vực Châu Á. Để khẳng định chắc chắn hơn điều này, chúng tơi đã thực hiện phân tích mối tương quan giữa tần suất xuất hiện của OXA-23 và mức độ kháng
carbapenem dựa trên kháng sinh đồ. Kết quả sẽ được trình bày ở mục 3 của chương này.
Ngoài các gen nằm trong phân lớp D, hiện nay các metallo-beta-lactamase (MBL) cũng đang là nhóm gen được cho là liên quan đến khả năng kháng carbapenem mạnh ở A. baumannii. MBL thường được mã hóa trên các gen cassette nằm trong các integron và dễ dàng lan truyền giữa các chủng A. baumannii. Tuy nhiên so với các nghiên cứu về các gen thuộc phân lớp D, các metallo-beta-lactamase thuộc phân lớp B cịn ít được đề cập đến. Chính vì vậy trong nghiên cứu này chúng tôi cũng đã lựa chọn 2 gen ở nhóm này để nghiên cứu bao gồm IMP và VIM. Tuy nhiên tần suất xuất hiện của hai gen này khá thấp, dưới 10 %, trong đó mẫu VIM chỉ xuất hiện duy nhất một lần và IMP là 5/100 mẫu. So sánh với các nghiên cứu khác trên thế giới thì tỷ lệ này thấp hơn đáng kể mặc dù bản thân các gen thuộc phân lớp B cũng được coi là nhóm gen khơng xuất hiện với tần suất cao. Một nghiên cứu ở Iran của Mansour và cộng sự đã thu được kết quả với 13,0 % IMP và 22,1 % VIM [2]. Trong khi đó nghiên cứu tại Ai Cập của Naswa và cộng sự lại thu được đến 95 % IMP nhưng không nhận được bất kỳ mẫu nào có VIM [4]. Các nghiên cứu khác ở Việt Nam về các gen thuộc nhóm này cũng hạn chế về số lượng. Tuy nhiên các nghiên cứu gần đây cho kết quả tương đối tương đồng với nghiên cứu của tôi. Cũng trong nghiên cứu của Lê Nữ Xuân Thanh và cộng sự tại hai bệnh viện tại Huế tỷ lệ IMP được tìm thấy là 4,4 % và và
VIM cũng không xuất hiện trong bất cứ mẫu A. baumannii phân lập nào còn IMP chỉ
xuất hiện với tần suất là 1/330 mẫu chiếm chưa đến 1 % [71]. Mặc dù được nhận định là có liên quan đến khả năng kháng carbapenem tuy nhiên với tần số xuất hiện quá thấp rất khó để tìm được mối liên hệ của nhóm gen này với mức độ kháng kháng sinh của A. baumannii.
Đối với kết quả của 10 mẫu không xuất hiện bất cứ gen nào chúng tôi đã đưa ra giả thiết rằng phản ứng PCR đa mồi có thể khơng đặc hiệu, vì vậy chúng tơi đã tiến hành kiểm tra lại bằng PCR đơn mồi với tỷ lệ khuôn tăng gấp đôi tuy nhiên kết quả khơng thay đổi chính vì vậy chúng tơi đã đưa ra kết luận rằng có thể 10 mẫu đó khơng mang bất cứ gen mục tiêu nào hoặc số lượng bản copy là quá nhỏ chưa đủ để lên băng điện di. Trong những nghiên cứu tiếp theo việc xác định giới hạn phát hiện là cần thiết để đánh giá độ nhạy của phương pháp. Ngoài ra việc tiến hành phát hiện có thể được phát triển trên các kỹ thuật nhạy hơn của Real-time PCR hoặc LAMP để có kết quả chính xác hơn với nhưng mẫu mà nồng độ DNA thu được là không cao.