Hình 15 : Mức độ tương đồng về acid amin
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.4.3. Các cặp mồi sử dụng
Phản ứng PCR đa mồi khuếch đại đồng thời các đoạn trình tự DNA đích, các cặp mồi đặc hiệu được chọn để nhân lên các đoạn trình tự đích có kích thước khác nhau, có thể phân tách rõ khi điện di.
Bảng 4: Trình tự các cặp mồi cho các gen OXA-23, OXA-51, VIM và IMP
STT Gen đích Cặp mồi (5’-3’) Sản phẩm (bp)
1 OXA-23 Fw – GAT CGG ATT GGA GAA CCAGA Rv – ATT TCT GAC CGC ATT TCC AT [53]
501
2 OXA-51 Fw – TAA TGC TTT GATCGG CCT TG Rv – TGG ATT GCA CTT CAT CTT GG [53]
353
3 VIM Fw – GATGGTGTTTGGTCGCATA
Rv – CGAATGCGCAGCACCAG [35]
390
4 IMP Fw – GGAATAGAGTGGCTTAAYTCTC
Rv – CCA AAC YAC TAS GTT ATC T [35]
188
2.2.4.4 Thành phần phản ứng
Bảng 5: Các thành phần tham gia phản ứng Multiplex PCR
Tên thành phần Nồng độ/thể tích
Khn DNA 2 µl
dNTP 0,3 mM
Green Taq Buffer 2X
Enzyme Dream Taq polymerase 0,5U
Mồi F/R OXA-23 0,2 µM OXA-51 0,2 µM VIM 0,3 µM IMP 0,4 µM DMSO 8 %
Nước tinh khiết khử ion vừa đủ 12,5 µl
2.2.4.5 Chu trình nhiệt
Phản ứng multiplex PCR thực hiện với chu trình nhiệt: 5 phút khởi đầu ở 940C, giai đoạn tiếp theo gồm 30 chu kỳ (940C/30 giây; 500C/45 giây; 720C/50 giây), giai đoạn kết thúc ở 720C/5 phút. Và giữ lạnh ở 40C (nếu chưa điện di ngay). (Hình 7)
Hình 7: Chu trình nhiệt đã được tối ưu của phản ứng Multiplex PCR
2.2.4.6 Điện di
Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 2-3% đã bổ sung thuốc nhuộm Redsafe. Thuốc nhuộm RedSafe được bổ sung theo tỉ lệ 1 µl/ 20 ml gel agarose 2- 3%. 5 µl sản phẩm PCR và 3 µl thang chuẩn 100 bp (Thermo Scientific, Mỹ) sẽ được điện di trong đệm TAE 1X (Tris base 0,04 M, acid acetic 0,02 M và EDTA 1 mM).
Quá trình điện di kéo dài trong khoảng 45 phút ở 100 V. Sản phẩm PCR sau điện di được quan sát bằng UV và được chụp lại bằng hệ thống Gel Doc (Bio-Rad, Mỹ).
2.2.5. Phân tích kết quả
2.2.5.1. Phân tích trình tự DNA
Một số sản phẩm PCR cần quan tâm được gửi đi giải trình tự. Sản phẩm PCR chứa các đoạn gen đích khơng cần tinh sạch (do có nồng độ cao (>20ng/l)) được đem đi giải trình tự tại cơng ty Macrogen (Hàn Quốc) [75], sử dụng phương pháp giải trình tự Sanger . Kết quả giải trình tự sẽ được phân tích bằng phần mềm Snap Gene để tìm vị trí bắt cặp mồi đặc hiệu trên kết quả giải trình tự, từ đó đoạn trình tự đích sẽ được so sánh với trình tự tham chiếu trên ngân hàng gene NCBI. Sau khi xác định được trình tự phù hợp với gen tham chiếu, tiếp tục sử dụng các công cụ, phần mềm hỗ trợ cho việc xử lí kết quả về trình tự gen như BLAST 2.9.0, CLUSTALW, MEGA 7 nhằm xác định mức độ tương đồng giữa trình tự gen kiểm tra so với các trình tự khác trên thế giới.
Trình tự DNA được dịch sang trình tự protein bằng phần mềm CLUSTALW. Phần mềm MEGA 7 được sử dụng để xác định mức độ tương đồng giữa trình tự protein thu được với các trình tự khác trên thế giới.
2.2.5.2. Xử lý số liệu
Excel 2016 được sử dụng để phân tích và thống kê các số liệu liên quan đến tần suất xuất hiện các gen và so sánh tỷ lệ tương đồng của trình tự DNA và protein của các mẫu thử nghiệm.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tần suất có mặt của các gen kháng kháng sinh trong hệ gen A. baumannii phân lập tại Bệnh viện Phổi Trung ương