Hình 15 : Mức độ tương đồng về acid amin
3.4. Phân tích trình tự một số mẫu để khẳng định độ chính xác của phương pháp
3.4.2. Phân tích những biến đổi trong trình tự của các chủng thu được và một số
chủng khác trên thế giới.
Nhóm nghiên cứu lựa chọn một số chủng dù chỉ mang gen mã hóa carbapenemase OXA-51 nhưng vẫn nhạy cảm với carbapenem để đi giải trình tự nhằm phát hiện sự khác biệt trong cấu trúc chuỗi cũng như so sánh về mức độ tương đồng so với các chủng tham chiếu và các chủng khác trên thế giới.
Bảng 10: Kết quả PCR và kháng sinh đồ một số chủng đem giải trình tự
STT Kết quả PCR Kết quả kháng sinh đồ
OXA-23 OXA-51 VIM IMP IMP DOR MEM
24 - + - -
25 - + - -
32 - + - -
35 - + - -
50 - + - -
Các đoạn trình tự OXA-51 ở các chủng 24, 25, 32, 35, 50 được lựa chọn giải trình tự. Kết quả cho thấy có 17 vị trí có sự thay đổi nucleotide so với gen tham chiếu. Tuy nhiên chỉ có 6 vị trí thay đổi dẫn đến sự thay đổi của acid amin (Bảng 12). Các vị trí cịn lại khơng có sự thay đổi là do tính thối hóa của mã bộ ba.
Bảng 11: Sự thay đổi nucleotide và acid amin so với trình tự tham chiếu
Vị trí nucleotide Các thay đổi về nucleotide Các thay đổi về acid amin
294 CT Giữ nguyên
301 GA (101) valineisoleusine
315 CT Giữ nguyên
318 GT Giữ nguyên
319 CA Giữ nguyên
328 CT (107) glutaminlysine
330 AG Giữ nguyên
349 GA (117) acid asparaginic
asparagine
366 TC Giữ nguyên
369 TC Giữ nguyên
390 GA Giữ nguyên
426 AG Giữ nguyên
438 GT (146) lysineasparagine
540 GA Giữ nguyên
581 C A (194) proline glutamine
587 TC (196) valine alanine
Tất cả các chủng đều có mức tương đồng cao (lớn hơn 97%) so với gen tham chiếu. Chủng số 50 tương đồng ở mức cao nhất (99,1%). Tiếp theo đó là chủng số 32 có mức tương đồng là 98,9%; chủng số 24, 25 đều có mức tương đồng là 98,6% và cuối cùng là chủng số 35 có mức tương đồng 97,7%. (Hình 14)
Hình 14: Mức độ tương đồng về nucleotide
Về trình tự acid amin, chủng số 24 và 25 có ba vị trí biến đổi so với gen tham chiếu đó là vị trí 117 (axit asparaginic thay bằng asparagine), 146 (lysine thay bằng asparagine) và 194 (proline thay bằng glutamin). Chủng số 35 cũng có hai vị trí biến đổi là 107 (glutaminlysine) và 194 (proline thay bằng glutamin). Chủng số 32 có hai vị trí biến đổi tuy nhiên đó là vị trí 101 (valine thay bằng isoleucine), 194 (proline thay bằng glutamin). Riêng chủng số 50 có mức tương đồng cao về trình tự nucleotide cũng có mức độ tương đồng cao về trình tự acid amin (99,1%) (Hình 15), chỉ có một
vị trí biến đổi đó là 196 (valine thay bằng alanine). Kết quả thu thập và phân tích cùng với 37 dữ liệu về trình tự acid amin của gen OXA-51 có độ tương đồng trên 90% so với các gen đem giải trình tự cho thấy isoleucine ở vị trí 101 xuất hiện với tỉ lệ 25%; glysine ở vị trí 107 xuất hiện với tỉ lệ 43,2%; glutamine ở vị trí 194 xuất hiện với tỉ lệ 76,9%. Trong khi đó, tỉ lệ asparagine ở vị trí 117, asparagine ở vị trí 146 và alanine ở vị trí 196 lần lượt xuất hiện với tỉ lệ là 16,3%; 18,6%; 2,3%. Các biến đổi vị trí acid amin 101, 117, 146, 194 so với gen tham chiếu đã được báo cáo trước đó nằm trong các biến thể của OXA-51 [9].
Hình 15: Mức độ tương đồng về acid amin
Nghiên cứu cũng đã chỉ ra các biến đổi trong gen OXA-51 hầu hết đã có ở các chủng khác trên thế giới. Như vậy về định hướng trong tương lai, nghiên cứu có thể mở rộng thêm trong việc thu thập các trình tự nhằm góp phần xây dựng cây phát sinh chủng lồi.
KẾT LUẬN
1. Kết quả PCR đa mồi đối với 100 mẫu A. baumannii tại Bệnh viện phổi Trung ương cho thấy sự chiếm ưu thế của các beta-lactamase thuộc phân lớp D với
OXA-51 là 88 % và OXA-23 là 77 %. Trong khi các gen thuộc phân lớp B lại
xuất hiện với tần suất khá thấp 5 % đối với IMP và chỉ có duy nhất một mẫu xuất hiện VIM chiếm tỷ lệ 1 %. Tổ hợp hai gen OXA-51 và OXA-23 là tổ hợp xuất hiện với tỷ lệ cao nhất 68 %.
2. Sự vắng mặt gen OXA-23 có thể làm tăng tính nhạy cảm với carbapenem của các chủng A. baumannii trong nghiên cứu.
3. Ít nhất 95 % các mẫu A. baumannii trong nghiên cứu là các chủng đa kháng kháng sinh. Tỷ lệ kháng cao nhất đối với các kháng sinh thuộc nhóm beta-lactam thử nghiệm bao gồm cả các kháng sinh thuộc nhóm carbapenem, tất cả đều trên 90%. A. baumannii có tỷ lệ nhạy cảm cao nhất với các kháng sinh nằm trong nhóm tetracycline (26-55%)
4. Phản ứng multiplex PCR đã tối ưu hóa đảm bảo nhân lên được chính xác vị trí các đoạn gen đích. Kết quả giải trình tự 5 đoạn gen OXA-51 tìm ra được 6 điểm khác biệt về acid amin so với các mẫu tham chiếu. Các biến đổi đã xuất hiện ở nhiều chủng trên thế giới.
KIẾN NGHỊ VÀ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO
1. Tiếp tục tối ưu hóa kỹ thuật PCR đa mồi và phát triển tiếp tục đề tài trên các kỹ thuật nhạy hơn như Real-time PCR để có kết quả chính xác hơn với nhưng mẫu mà nồng độ DNA thấp.
2. Mở rộng cỡ mẫu đồng thời nghiên cứu phát hiện các gen khác liên quan đến khả năng kháng kháng sinh của A. baumannii kết hợp với nghiên cứu các cơ chế ngoài beta-lactamase.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Anh:
1. Abhisek R, P. Lavanya, R. Soniya (2013), “Multiplex PCR for genes encoding prevalent OXA and NDM-1 carbapenemases in Acinetobacter”, Journal of pharmacy research, 7(4), pp.324–326.
2. Afsaneh K, Shahin N.P, Ali H.S (2013), “Distribution of OXA-Type Class D β- Lactamase Genes Among Nosocomial Multi Drug Resistant Acinetobacter baumannii Isolated in Tehran Hospitals”, Jundishapur Journal of Microbiology,
6(5).
3. Aksoy M.D, Çavuşlu Ş, Tuğrul H.M et al (2015), “Investigation of Metallo Beta Lactamases and Oxacilinases in Carbapenem Resistant Acinetobacter baumannii Strains Isolated from Inpatients”, Balkan medicine journal, 32, pp. 79-83.
4. Alkasaby N.M, El Sayed Zaki M (2017), “Molecular Study of Acinetobacter baumannii Isolates for Metallo-β-Lactamases and Extended-Spectrum-β-
Lactamases Genes in Intensive Care Unit, Mansoura University Hospital, Egypt.”,
International journal of microbiology, 3925868.
5. Anton Y.P, Harald S, David L.P (2008), “Acinetobacter baumannii: Emergence of a Successful Pathogen”, Clinical Microbiology Review, 21(3), pp. 538–582. 6. Antunes L.C, Visca P, Towner K.J (2014), “Acinetobacter baumannii: evolution
of a global pathogen”. Pathogens and Disease, 71(3), pp. 292-301.
7. Antunes N.T, Lamoureaux T.L, Toth M et al (2014), “Class D β-lactamases: are they all carbapenemases?”, Antimicrobial agents and chemotherapy, 58(4), pp.
2119-2125.
8. Asif M, Alvi I.A, Rehman S.U (2018), “Insight into Acinetobacter baumannii: pathogenesis global resistance, mechanisms of resistance, treatment options, and alternative modalities”, Infection and drug resistance, 11, pp. 1249-1260.
9. Benjamin Andrew Evans (2010), Thesis “Significance of the OXA-51-like β- lactamases of Acinetobacter baumannii”.
10. Biglari S, Alfizah H, Ramliza R, Rahman M.M (2015), “Molecular characterization of carbapenemase and cephalosporinase genes among clinical
isolates of Acinetobacter baumannii in a tertiary medical centre in Malaysia”, Journal of Medical Microbiology, 64, pp. 53–58.
11. Bogaerts P, Naas T, El Garch F et al (2010), “GES Extended-Spectrum beta- Lactamases in Acinetobacter baumannii Isolates in Belgium”, Antimicrobial
agents and chemotherapy, 54(11), pp. 4872–4878.
12. Brown S, Young H.K, Amyes S.G (2005), “Characterisation of OXA-51, a novel class D carbapenemase found in genetically unrelated clinical strains of
Acinetobacter baumannii from Argentina.”, Clinical microbiology and infection,
11(1), pp. 15-23.
13. Calderon C. B. & Sabundayo B. P. (2007), “Antimicrobial classifications: Drugs for bugs”, Antimicrobial susceptibility testing protocols. CRC Press, Taylor and Frances group.
14. Diene S.M, Rolain J.M (2014), “Carbapenemase genes and genetic platforms in Gram-negative bacilli: Enterobacteriaceae, Pseudomonas and Acinetobacter species.”, Clinical microbiology and infection, 20(9), pp.831-838.
15. Dijkshoorn L, Nemec A, Seifert H (2007), “An increasing threat in hospitals: multidrug-resistant Acinetobacter baumannii”, Nature review – Microbiology,
5(12), pp. 939-951.
16. Ebimieowei E, Ibemologi A (2016), “Antibiotics: Classification and mechanisms of action with emphasis on molecular perspectives”, International Journal of
Applied Microbiology and Biotechnology Research, 4, pp. 90-101.
17. Ellis D, Cohen B, Liu J, Larson E (2015), “Risk factors for hospital-acquired antimicrobial-resistant infection caused by Acinetobacter baumannii”, Antimicrobial Resistance and Infection Control, 4:40.
18. Evans B.A, Amyes S.G (2014), “OXA β-Lactamases”, Clinical Microbiology Reviews, 27(2), pp. 241-263.
19. Evans B.A, Hamouda A, Towner K.J, Amyes S.G (2008), “OXA-51-like beta- lactamases and their association with particular epidemic lineages of
20. Firoz K (2018), “Antibiotics Classification and Visual Target Sites for Bacterial Inhibition”, Advances in Pharmacology and Clinical Trials, 3, Issue 3.
21. Francesca L, Claudia V, Gianfranco D (2014), “Biofilm formation in
Acinetobacter baumannii”, New Microbiologica, 37, pp. 119-127.
22. Francis S.C, Eric S.D (2018), “Carbapenem Resistance: A Review”, Medical sciences, 6(1).
23. Hasan B, Perveen K, Olsen B, Zahra R (2014), “Emergence of Carbapenem resistant Acinetobacter baumannii in the hospitals from Pakistan”, Journal of Medical Microbiology, 63, pp. 50–55.
24. Héritier C, Poirel L, Lambert T, Nordmann P (2005), “Contribution of Acquired Carbapenem-Hydrolyzing Oxacillinases to Carbapenem Resistance in
Acinetobacter baumannii”, Antimicrobial agents and chemotherapy, 49(8), pp.
3198–3202.
25. Hou C, Yang F (2015), “Drug-resistant gene of blaOXA-23, blaOXA-24, blaOXA-51 and blaOXA-58 in Acinetobacter baumannii”, International journals
of clinical and experimental medicine, 8(8), pp. 13859-13863.
26. Hsu L.Y, Apisarnthanarak A, Khan E et al (2014), “Carbapenem-Resistant Acinetobacter baumannii and Enterobacteriaceae in South and Southeast Asia.”
Clinical microbiology reviews, 30(1), pp. 1-22.
27. Joshi P.R, Acharya M, Kakshapati T et al (2017), “Co-existence of blaOXA-23 and blaNDM-1 genes of Acinetobacter baumannii isolated from Nepal : antimicrobial resistance and clinical significance” , Antimicrobial Resistance and
Infection Control, 6:21.
28. Kusradze I, Diene S.M, Goderdzishvili M, Rolain J.M (2018), “Molecular detection of OXA carbapenemase genes in multidrug-resistant Acinetobacter
baumannii isolates from Iraq and Georgia.”, International journals of
antimicrobial agents, 38(2), pp.164-168.
29. Lee C.R, Lee J.H, Park M et al (2017), “Biology of Acinetobacter baumannii:
Pathogenesis, Antibiotic Resistance Mechanisms, and Prospective Treatment Options”, Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, 7:55.
30. Leite G.C, Oliveira M.S, Perdigão-Neto L.V et al (2016), “Antimicrobial
Combinations against Pan-Resistant Acinetobacter baumannii Isolates with
Different Resistance Mechanisms.”, PloS One, 11(3).
31. Li P, Niu W1 Li H et al (2015), “Rapid detection of Acinetobacter baumannii and molecular epidemiology of carbapenem-resistant A. baumannii in two
comprehensive hospitals of Beijing, China.”, Frontier in microbiology, 6:997. 32. Lin M.F, Lan C.Y (2014), “Antimicrobial resistance in Acinetobacter baumannii:
From bench to bedside”, World J Clin Cases, 2(12), pp. 787-814.
33. Magiorakos A.P, Srinivasan A, Carey R.B et al (2012), “Multidrug-resistant,
extensively drug-resistant and pandrug-resistant bacteria: an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance”, Clinical microbiology and infection, 18(3), pp. 268-81.
34. Martins N, Picão R.C, Cerqueira-Alves M et al (2016), “A new trilocus sequence- based multiplex-PCR to detect major Acinetobacter baumannii clones”, Infection,
Genetics and Evolution, 42, pp.41-45.
35. Matthew J.E, James K, David M.L, Woodford N, (2007), “Multiplex PCR for rapid detection of genes encoding acquired metallo-β-lactamases”, Journal of Antimicrobial Chemotherapy, pp. 321-322.
36. Mohajeri P, Farahani A, Feizabadi M.M et al (2013), “Antimicrobial susceptibility profiling and genomic diversity of Acinetobacter baumannii
isolates: A study in western Iran.”, Iranian journal of microbiology, 5, pp. 195- 202.
37. Mugnier P.D, Poirel L, Naas T, Nordmann P (2010), “Worldwide dissemination of the blaOXA-23 carbapenemase gene of Acinetobacter baumannii.”, Emerging
Infectious Diseases, 16(1), pp. 35-40.
38. Munita J.M, Arias C.A (2016), “Mechanisms of Antibiotic Resistance”,
Microbiology spectrum, 4(2).
39. Neves F.C, Clemente W.T, Lincopan N et al (2016), “Clinical and microbiological characteristics of OXA-23 and OXA-143- producing
Acinetobacter baumannii in ICU patients at a teaching hospital, Brazil.”, The Brazilian Journal of infectious diseases, 20(6), pp. 556–563.
40. Novovic K, Mihajlovic S, Vasiljevic Z et al (2015), “Carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii from Serbia: revision of CarO classification”, PloS One,
10(3).
41. Nowak P, Paluchowska P, Budak A (2012) “Distribution of blaOXA genes among carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii nosocomial strains in Poland”,
New Microbiologica, 35, pp. 317-325.
42. Perez F, Hujer A.M, Hujer K.M, et al (2007), “Global Challenge of Multidrug-
Resistant Acinetobacter baumannii”, Antimicrobial agents and chemotherapy,
51(10), pp. 3471–3484.
43. Peters L, Olson L, Khu D.T.K et al (2019), “Multiple antibiotic resistance as a risk factor for mortality and prolonged hospital stay: A cohort study among neonatal intensive care patients with hospital-acquired infections caused by gram- negative bacteria in Vietnam”, PloS One, 14(5).
44. Raible K.M, Sen B, Law N et al (2017), “Molecular characterization of β-
lactamase genes in clinical isolates of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii.”, Annals of clinical microbiology and antimicrobials,16(1):75.
45. Ramadan R.A, Gebriel M.G, Kadry H.M, Mosallem A (2018), “Carbapenem- resistant Acinetobacter baumannii and Pseudomonas aeruginosa:
characterization of carbapenemase genes and E-test evaluation of colistin-based combinations.”, Infection and Drug Resistance, 11, pp. 1261-1269.
46. Ramette A, Kronenberg A (2018), “Prevalence of carbapenem-resistant
Acinetobacter baumannii from 2005 to 2016 in Switzerland”, BMC Infectious
Diseases,18(1):159.
47. Rolain J.M, Loucif L, Al-Maslamani M et al (2016), “Emergence of multidrug- resistant Acinetobacter baumannii producing OXA-23 Carbapenemase in Qatar.”,
48. Smith C.A, Antunes N.T, Stewart N.K et al (2013), “Structural basis for
carbapenemase activity of the OXA-23 β-lactamase from Acinetobacter baumannii.”, Chemistry and biology, 20(9), pp. 1107–1115.
49. Tan TY, Hsu L.Y, Koh T.H et al (2008), “Antibiotic resistance in gram-negative bacilli: a Singapore perspective.”, Annals of the Academy of Medicine-Singapore, 37, pp. 819-825.
50. Turton J.F, Woodford N, Glover J et al (2006), “Identification of Acinetobacter baumannii by Detection of the blaOXA-51-like Carbapenemase Gene Intrinsic to
This Species”, Journal of clinical microbiology, 44(8), pp. 2974-2976.
51. Vahaboglu H, Budak F, Kasap M et al (2006), “High prevalence of OXA-51-type class D b-lactamases among ceftazidime-resistant clinical isolates of Acinetobacter spp.: co-existence with OXA-58 in multiple centres”, Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 58, pp. 537–542.
52. Wang D, Yan D, Hou W et al (2015), “Characterization of blaOxA-23 gene regions in isolates of Acinetobacter baumannii.”, Journal of Microbiology, Immunology and Infection, 48, pp. 284-290.
53. Woodford N. Ellington M. J, Coelho J. M, Turton J. F, et al (2006), “Multiplex PCR for genes encoding prevalent OXA carbapenemases in Acinetobacter spp”.
International Journal of Antimicrobial Agents, pp. 351–353
54. Xie R, Zhang X.D, Zhao Q, Peng B, Zheng J (2018), “Analysis of global prevalence of antibiotic resistance in Acinetobacter baumannii infections
disclosed a faster increase in OECD countries”, Emerging Microbes & Infections, 7:31.
55. Xin W, Li-Jie Q (2019), “A review on Acinetobacter baumannii”, Journal of Acute Disease, 8(1), pp. 16-20.
56. Yang Y, Xu Q, Li T et al (2019), “OXA-23 Is a Prevalent Mechanism Contributing to Sulbactam Resistance in Diverse Acinetobacter baumannii
57. Zhao Y, Hu K, Zhang J et al (2019), “Outbreak of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii carrying the carbapenemase OXA-23 in ICU of the
eastern Heilongjiang Province, China.”, BMC Infectious Diseases, 19(1):452.
Tài liệu tiếng Việt:
58. Bộ Y tế (2015), “Hướng dẫn sử dụng kháng sinh”, Nhà xuất bản Y học.
59. Bộ Y tế (2017), “Hướng dẫn thực hành xét nghiệm vi sinh lâm sàng”, Nhà xuất bản Y học.
60. Bùi Hồng Giang (2013), “Nghiên cứu đặc điểm vi khuẩn và điều trị nhiễm khuẩn bệnh viện tại khoa Hồi sức tích cực Bệnh viện Bạch Mai 2012”, Luận văn Thạc sĩ Y học, Đại học Y Hà Nội.
61. Hà Sơn Bình (2015), “Nhận xét một số yếu tố liên quan và hiệu quả điều trị ở bệnh nhân viêm phổi liên quan đến thở máy”, Luận văn Bác sỹ chuyên khoa cấp 2, Bệnh viện Bạch Mai.
62. Huỳnh Hồng Quang (2018), “Nghiên cứu ứng dụng quan kỹ thuật LAMP trong chẩn đoán và phát hiện các tác nhân gây bệnh truyền nhiễm”, Viện sốt rét ký sinh trùng côn trùng Quy Nhơn.
63. Lê Nữ Xuân Thanh, Lê Thị Ánh Ngọc, Nguyên Thị Nam Liên và cộng sự (2017), “Đặc điểm gen mã hóa Carbapenemase của các chủng Acinetobacter baumannii kháng thuốc Carbapenem”, Tạp chí Y Dược học - Trường Đại học Y Dược Huế, tập 7, số 5, trang 52-57.
64. Ngô Thị Hồng Phương, Nguyễn Quốc Hiệu, Cao Hữu Nghĩa và cộng sự (2013), “ Tình hình kháng kháng sinh của Acinetobacter baumannii phát hiện được tại
viện Pasteur TP Hồ Chí Minh”, Tạp chí Khoa học ĐHSP TP Hồ Chí Minh, số 47, trang 112-118.
65. Nguyễn Đắc Trung, Nguyễn Thị Huyền (2017), “Đặc điểm kháng kháng sinh của các chủng Acinetobacter baumannii phân lập tại Thái Nguyên”, Tạp chí Y dược
học Quân sự, số 2, trang 40-44
66. Nguyễn Thị Thanh Bình, Vũ Đình Thắng (2014), “Khảo sát đặc điểm đề kháng kháng sinh của vi khuẩn gây viêm phổi bệnh viện ở bệnh nhân máy điều trị tại
khoa Hồi sức tích cực bệnh viện 115”, Y học TP Hồ Chí Minh, tập 18, phụ bản số