Hình 15 : Mức độ tương đồng về acid amin
3.2.4. Đánh giá chung
Dựa trên tiêu chuẩn đánh giá mức độ kháng kháng sinh đối với A. baumannii, có 60/63 chủng A. baumannii thu được xếp vào mức độ đa kháng sinh (MDR), kháng ít nhất 1 kháng sinh trong 3 nhóm kháng sinh khác nhau, chiếm tới 95 %. Trong đó có 21/63 chủng kháng toàn bộ các kháng sinh thử nghiệm, những chủng này có khả năng nằm trong nhóm siêu kháng (XDR) hoặc thậm chí tồn kháng (PDR). Đồng thời có 3 mẫu chỉ kháng kháng sinh trong 1-2 nhóm, đây có thể là những chủng nhạy cảm. Tuy nhiên do các dữ liệu về kháng sinh đồ chưa đầy đủ theo đúng tiêu chuẩn đánh giá nên nhóm nghiên cứu chưa thể đưa ra kết luận cụ thể về khả năng kháng của các mẫu này trong các trường hợp nói trên. Trong thời gian tới việc tiến hành kháng sinh đồ đầy đủ theo đúng tiêu chuẩn đánh giá mức độ nhạy cảm của A. baumannii là rất cần thiết để có thể đưa ra tầm nhìn tổng quát hơn về các chủng A. baumannii đang lưu hành tại Việt Nam.
3.3. So sánh kết quả sự có mặt của các gen và khả năng kháng kháng sinh dựa trên kháng sinh đồ và xác định mối liên quan.
Kết hợp tần suất xuất hiện của các gen đích và kết quả kháng sinh đồ của carbapenem chúng tôi thu được bảng tổng hợp sau:
Bảng 9: Kết quả PCR và kháng sinh đồ của các mẫu A. baumannii
PCR Kết quả kháng sinh đồ
OXA 23 OXA 51 VIM IMP IMP DOR MEM
24 - + - - 25 - + - - 30 + + - - 31 + + - - 32 - + - - 33 + + - - 35 - + - - 39 + + - - 42 + + - - 43 + + - - 44 + + - - 45 + + - - 46 + + - - 47 + + - - 48 + + - - 49 + + - - 50 - + - - 51 + + - - 52 + + - - 53 + + - - 54 + + - - 56 + + - - 57 + + - - 58 + + - - 59 + + - - 60 + + - - 61 + + - - 62 + + - - 63 - - - - 64 - - - - 65 + + - - 66 + + - - 67 + + - -
*Chú thích: (+) xuất hiện gen; (-) khơng xuất hiện
Kháng Trung gian Nhạy cảm Khơng có thơng tin
Kết quả đánh giá mối tương quan giữa khả năng kháng carbapenem với sự có mặt của bốn gen đích mã hóa carbapenemase cho thấy ở những chủng mang hai gen
OXA-23 và OXA-51 kháng 100% với các kháng sinh carbapenem thử nghiệm. Trong
tổng số 63 chủng vi khuẩn A. baumannii được chỉ định kháng sinh đồ có 10 chủng chỉ mang gen OXA-51 với mức độ kháng với mỗi loại kháng sinh ở mỗi chủng là khác nhau (Bảng 10). Trong đó, 5 chủng là kháng hồn tồn với hai kháng sinh imipenem
68 + + - - 69 + + - - 70 + + - - 71 + + - - 72 + + - - 73 + + - - 74 + + - - 75 - + - - 76 + + - - 78 + + - - 79 + + - - 80 + + - - 81 - + - - 83 + + - - 84 + + - - 85 - - - + 86 - - - - 87 + + - - 89 + + - - 90 + + - - 91 + + - - 92 + + - - 93 + + - - 94 + + - - 95 - + - - 96 - - - + 97 + + - - 98 + + - - 99 - + - - 100 - + - -
và meropenem (khơng có thơng tin về doripenem). Trong các chủng cịn lại có thử nghiệm với doripenem thì một chủng nhạy cảm và một chủng là kháng trung gian. Từ đây chúng ta có thể thấy sử dụng imipenem có thể cho kết quả tốt hơn ở những chủng này.
Như đã phân tích ở mục 3.1 sự xuất hiện phổ biến và khả năng tạo ra sản phẩm thủy phân mạnh đối với carbapenem đã đưa OXA-23 trở thành cơ chế chính kháng carbapenem của A. baumannii. Dựa vào kết quả của bảng tổng hợp nghiên cứu, chúng tôi càng khẳng định giả thiết này. Trong các mẫu khơng có sự xuất hiện của gen OXA-
23 bao gồm 24,25,32,50,86,99 kết quả kháng sinh đồ cho thấy khả năng nhạy cảm
cao hơn với các carbapenem thử nghiệm từ nhạy cảm đến mức độ kháng trung gian thay vì kháng hồn tồn như các mẫu có OXA-23. Tuy nhiên do việc thực hiện kháng sinh đồ chưa tồn diện, một số mẫu khơng có gen OXA-23 nhưng lại thiếu thơng tin về mức độ với doripenem nên mối liên hệ này còn chưa được khẳng định đối với các mẫu này. Có hai trường hợp ngoại lệ trong bảng tổng hợp trên cần được xem xét đó là mẫu 63, 64 cả hai mẫu này đều không phát hiện gen OXA-23 nhưng kháng tồn bộ 3 carbapenem điều này khiến chúng tơi nghĩ đến sự tồn tại của một cơ chế kháng kháng ngoài beta-lactamase đối với các chủng này hoặc do sự có mặt của một gen thuộc phân lớp khác. Tuy nhiên sự kết hợp đồng thời giữa OXA-51 với OXA-23 có thể đã làm tăng tính kháng của A. baumannii (thành 100%). Như vậy định hướng cho nhóm nghiên cứu trong tương lai là tiếp tục lựa chọn phát hiện các gen liên quan đến khả năng kháng kháng sinh khác kết hợp với các cơ chế ngoài sản xuất enzyme carbapenemase.
Hai metallo-beta-lactamase IMP, VIM trong nghiên cứu của chúng tôi thu
được đều có tần suất xuất hiện thấp điều này gây ra khó khăn trong việc xác định mối tương quan của các gen này với khả năng kháng carbapenem, mặc dù cả hai mẫu của sự xuất hiện của IMP đều kháng hồn tồn với imipenem và meropenem.
3.4. Phân tích trình tự một số mẫu để khẳng định độ chính xác của phương pháp và tìm hiểu sự khác biệt giữa các chủng thu được và một số chủng khác trên và tìm hiểu sự khác biệt giữa các chủng thu được và một số chủng khác trên thế giới.
3.4.1. Phân tích trình tự nhằm khẳng định độ chính xác của phương pháp
Để khẳng định kết quả của phương pháp sản phẩm PCR được kiểm tra một lần nữa bằng phản ứng PCR đơn mồi với các cặp mồi đặc hiệu. Ảnh điện di của phản ứng PCR đều xuất hiện các băng đặc hiệu. Vì vậy, các sản phẩm PCR được gửi đi giải trình tự cùng với mồi xi và mồi ngược của từng gen liên quan. Trình tự gen được đọc và tìm đầy đủ dựa trên kết quả giải trình tự bằng phần mềm Snap Gene (Hình 13). Kết quả thu được của các trình tự đích được lựa chọn của hai gen OXA-
23, OXA-51 khi so sánh trên ngân hàng gen đều thu được kết quả tương đồng 99%-
100% với nhiều chủng ứng với loài vi khuẩn này (Hình 14). Như vậy phản ứng multiplex PCR đã được tối ưu hóa đảm bảo nhân lên được chính xác các gen đích.
Hình 13
A: Kết quả giải trình tự gen OXA-51 với mồi ngược. B: So sánh kết quả giải trình tự với ngân hàng gen
3.4.2. Phân tích những biến đổi trong trình tự của các chủng thu được và một số chủng khác trên thế giới. chủng khác trên thế giới.
Nhóm nghiên cứu lựa chọn một số chủng dù chỉ mang gen mã hóa carbapenemase OXA-51 nhưng vẫn nhạy cảm với carbapenem để đi giải trình tự nhằm phát hiện sự khác biệt trong cấu trúc chuỗi cũng như so sánh về mức độ tương đồng so với các chủng tham chiếu và các chủng khác trên thế giới.
Bảng 10: Kết quả PCR và kháng sinh đồ một số chủng đem giải trình tự
STT Kết quả PCR Kết quả kháng sinh đồ
OXA-23 OXA-51 VIM IMP IMP DOR MEM
24 - + - -
25 - + - -
32 - + - -
35 - + - -
50 - + - -
Các đoạn trình tự OXA-51 ở các chủng 24, 25, 32, 35, 50 được lựa chọn giải trình tự. Kết quả cho thấy có 17 vị trí có sự thay đổi nucleotide so với gen tham chiếu. Tuy nhiên chỉ có 6 vị trí thay đổi dẫn đến sự thay đổi của acid amin (Bảng 12). Các vị trí cịn lại khơng có sự thay đổi là do tính thối hóa của mã bộ ba.
Bảng 11: Sự thay đổi nucleotide và acid amin so với trình tự tham chiếu
Vị trí nucleotide Các thay đổi về nucleotide Các thay đổi về acid amin
294 CT Giữ nguyên
301 GA (101) valineisoleusine
315 CT Giữ nguyên
318 GT Giữ nguyên
319 CA Giữ nguyên
328 CT (107) glutaminlysine
330 AG Giữ nguyên
349 GA (117) acid asparaginic
asparagine
366 TC Giữ nguyên
369 TC Giữ nguyên
390 GA Giữ nguyên
426 AG Giữ nguyên
438 GT (146) lysineasparagine
540 GA Giữ nguyên
581 C A (194) proline glutamine
587 TC (196) valine alanine
Tất cả các chủng đều có mức tương đồng cao (lớn hơn 97%) so với gen tham chiếu. Chủng số 50 tương đồng ở mức cao nhất (99,1%). Tiếp theo đó là chủng số 32 có mức tương đồng là 98,9%; chủng số 24, 25 đều có mức tương đồng là 98,6% và cuối cùng là chủng số 35 có mức tương đồng 97,7%. (Hình 14)
Hình 14: Mức độ tương đồng về nucleotide
Về trình tự acid amin, chủng số 24 và 25 có ba vị trí biến đổi so với gen tham chiếu đó là vị trí 117 (axit asparaginic thay bằng asparagine), 146 (lysine thay bằng asparagine) và 194 (proline thay bằng glutamin). Chủng số 35 cũng có hai vị trí biến đổi là 107 (glutaminlysine) và 194 (proline thay bằng glutamin). Chủng số 32 có hai vị trí biến đổi tuy nhiên đó là vị trí 101 (valine thay bằng isoleucine), 194 (proline thay bằng glutamin). Riêng chủng số 50 có mức tương đồng cao về trình tự nucleotide cũng có mức độ tương đồng cao về trình tự acid amin (99,1%) (Hình 15), chỉ có một
vị trí biến đổi đó là 196 (valine thay bằng alanine). Kết quả thu thập và phân tích cùng với 37 dữ liệu về trình tự acid amin của gen OXA-51 có độ tương đồng trên 90% so với các gen đem giải trình tự cho thấy isoleucine ở vị trí 101 xuất hiện với tỉ lệ 25%; glysine ở vị trí 107 xuất hiện với tỉ lệ 43,2%; glutamine ở vị trí 194 xuất hiện với tỉ lệ 76,9%. Trong khi đó, tỉ lệ asparagine ở vị trí 117, asparagine ở vị trí 146 và alanine ở vị trí 196 lần lượt xuất hiện với tỉ lệ là 16,3%; 18,6%; 2,3%. Các biến đổi vị trí acid amin 101, 117, 146, 194 so với gen tham chiếu đã được báo cáo trước đó nằm trong các biến thể của OXA-51 [9].
Hình 15: Mức độ tương đồng về acid amin
Nghiên cứu cũng đã chỉ ra các biến đổi trong gen OXA-51 hầu hết đã có ở các chủng khác trên thế giới. Như vậy về định hướng trong tương lai, nghiên cứu có thể mở rộng thêm trong việc thu thập các trình tự nhằm góp phần xây dựng cây phát sinh chủng loài.
KẾT LUẬN
1. Kết quả PCR đa mồi đối với 100 mẫu A. baumannii tại Bệnh viện phổi Trung ương cho thấy sự chiếm ưu thế của các beta-lactamase thuộc phân lớp D với
OXA-51 là 88 % và OXA-23 là 77 %. Trong khi các gen thuộc phân lớp B lại
xuất hiện với tần suất khá thấp 5 % đối với IMP và chỉ có duy nhất một mẫu xuất hiện VIM chiếm tỷ lệ 1 %. Tổ hợp hai gen OXA-51 và OXA-23 là tổ hợp xuất hiện với tỷ lệ cao nhất 68 %.
2. Sự vắng mặt gen OXA-23 có thể làm tăng tính nhạy cảm với carbapenem của các chủng A. baumannii trong nghiên cứu.
3. Ít nhất 95 % các mẫu A. baumannii trong nghiên cứu là các chủng đa kháng kháng sinh. Tỷ lệ kháng cao nhất đối với các kháng sinh thuộc nhóm beta-lactam thử nghiệm bao gồm cả các kháng sinh thuộc nhóm carbapenem, tất cả đều trên 90%. A. baumannii có tỷ lệ nhạy cảm cao nhất với các kháng sinh nằm trong nhóm tetracycline (26-55%)
4. Phản ứng multiplex PCR đã tối ưu hóa đảm bảo nhân lên được chính xác vị trí các đoạn gen đích. Kết quả giải trình tự 5 đoạn gen OXA-51 tìm ra được 6 điểm khác biệt về acid amin so với các mẫu tham chiếu. Các biến đổi đã xuất hiện ở nhiều chủng trên thế giới.
KIẾN NGHỊ VÀ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO
1. Tiếp tục tối ưu hóa kỹ thuật PCR đa mồi và phát triển tiếp tục đề tài trên các kỹ thuật nhạy hơn như Real-time PCR để có kết quả chính xác hơn với nhưng mẫu mà nồng độ DNA thấp.
2. Mở rộng cỡ mẫu đồng thời nghiên cứu phát hiện các gen khác liên quan đến khả năng kháng kháng sinh của A. baumannii kết hợp với nghiên cứu các cơ chế ngoài beta-lactamase.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Anh:
1. Abhisek R, P. Lavanya, R. Soniya (2013), “Multiplex PCR for genes encoding prevalent OXA and NDM-1 carbapenemases in Acinetobacter”, Journal of pharmacy research, 7(4), pp.324–326.
2. Afsaneh K, Shahin N.P, Ali H.S (2013), “Distribution of OXA-Type Class D β- Lactamase Genes Among Nosocomial Multi Drug Resistant Acinetobacter baumannii Isolated in Tehran Hospitals”, Jundishapur Journal of Microbiology,
6(5).
3. Aksoy M.D, Çavuşlu Ş, Tuğrul H.M et al (2015), “Investigation of Metallo Beta Lactamases and Oxacilinases in Carbapenem Resistant Acinetobacter baumannii Strains Isolated from Inpatients”, Balkan medicine journal, 32, pp. 79-83.
4. Alkasaby N.M, El Sayed Zaki M (2017), “Molecular Study of Acinetobacter baumannii Isolates for Metallo-β-Lactamases and Extended-Spectrum-β-
Lactamases Genes in Intensive Care Unit, Mansoura University Hospital, Egypt.”,
International journal of microbiology, 3925868.
5. Anton Y.P, Harald S, David L.P (2008), “Acinetobacter baumannii: Emergence of a Successful Pathogen”, Clinical Microbiology Review, 21(3), pp. 538–582. 6. Antunes L.C, Visca P, Towner K.J (2014), “Acinetobacter baumannii: evolution
of a global pathogen”. Pathogens and Disease, 71(3), pp. 292-301.
7. Antunes N.T, Lamoureaux T.L, Toth M et al (2014), “Class D β-lactamases: are they all carbapenemases?”, Antimicrobial agents and chemotherapy, 58(4), pp.
2119-2125.
8. Asif M, Alvi I.A, Rehman S.U (2018), “Insight into Acinetobacter baumannii: pathogenesis global resistance, mechanisms of resistance, treatment options, and alternative modalities”, Infection and drug resistance, 11, pp. 1249-1260.
9. Benjamin Andrew Evans (2010), Thesis “Significance of the OXA-51-like β- lactamases of Acinetobacter baumannii”.
10. Biglari S, Alfizah H, Ramliza R, Rahman M.M (2015), “Molecular characterization of carbapenemase and cephalosporinase genes among clinical
isolates of Acinetobacter baumannii in a tertiary medical centre in Malaysia”, Journal of Medical Microbiology, 64, pp. 53–58.
11. Bogaerts P, Naas T, El Garch F et al (2010), “GES Extended-Spectrum beta- Lactamases in Acinetobacter baumannii Isolates in Belgium”, Antimicrobial
agents and chemotherapy, 54(11), pp. 4872–4878.
12. Brown S, Young H.K, Amyes S.G (2005), “Characterisation of OXA-51, a novel class D carbapenemase found in genetically unrelated clinical strains of
Acinetobacter baumannii from Argentina.”, Clinical microbiology and infection,
11(1), pp. 15-23.
13. Calderon C. B. & Sabundayo B. P. (2007), “Antimicrobial classifications: Drugs for bugs”, Antimicrobial susceptibility testing protocols. CRC Press, Taylor and Frances group.
14. Diene S.M, Rolain J.M (2014), “Carbapenemase genes and genetic platforms in Gram-negative bacilli: Enterobacteriaceae, Pseudomonas and Acinetobacter species.”, Clinical microbiology and infection, 20(9), pp.831-838.
15. Dijkshoorn L, Nemec A, Seifert H (2007), “An increasing threat in hospitals: multidrug-resistant Acinetobacter baumannii”, Nature review – Microbiology,
5(12), pp. 939-951.
16. Ebimieowei E, Ibemologi A (2016), “Antibiotics: Classification and mechanisms of action with emphasis on molecular perspectives”, International Journal of
Applied Microbiology and Biotechnology Research, 4, pp. 90-101.
17. Ellis D, Cohen B, Liu J, Larson E (2015), “Risk factors for hospital-acquired antimicrobial-resistant infection caused by Acinetobacter baumannii”, Antimicrobial Resistance and Infection Control, 4:40.
18. Evans B.A, Amyes S.G (2014), “OXA β-Lactamases”, Clinical Microbiology Reviews, 27(2), pp. 241-263.
19. Evans B.A, Hamouda A, Towner K.J, Amyes S.G (2008), “OXA-51-like beta- lactamases and their association with particular epidemic lineages of
20. Firoz K (2018), “Antibiotics Classification and Visual Target Sites for Bacterial Inhibition”, Advances in Pharmacology and Clinical Trials, 3, Issue 3.
21. Francesca L, Claudia V, Gianfranco D (2014), “Biofilm formation in
Acinetobacter baumannii”, New Microbiologica, 37, pp. 119-127.
22. Francis S.C, Eric S.D (2018), “Carbapenem Resistance: A Review”, Medical sciences, 6(1).
23. Hasan B, Perveen K, Olsen B, Zahra R (2014), “Emergence of Carbapenem resistant Acinetobacter baumannii in the hospitals from Pakistan”, Journal of Medical Microbiology, 63, pp. 50–55.
24. Héritier C, Poirel L, Lambert T, Nordmann P (2005), “Contribution of Acquired Carbapenem-Hydrolyzing Oxacillinases to Carbapenem Resistance in
Acinetobacter baumannii”, Antimicrobial agents and chemotherapy, 49(8), pp.
3198–3202.
25. Hou C, Yang F (2015), “Drug-resistant gene of blaOXA-23, blaOXA-24, blaOXA-51 and blaOXA-58 in Acinetobacter baumannii”, International journals
of clinical and experimental medicine, 8(8), pp. 13859-13863.
26. Hsu L.Y, Apisarnthanarak A, Khan E et al (2014), “Carbapenem-Resistant Acinetobacter baumannii and Enterobacteriaceae in South and Southeast Asia.”
Clinical microbiology reviews, 30(1), pp. 1-22.
27. Joshi P.R, Acharya M, Kakshapati T et al (2017), “Co-existence of blaOXA-23 and blaNDM-1 genes of Acinetobacter baumannii isolated from Nepal : antimicrobial resistance and clinical significance” , Antimicrobial Resistance and
Infection Control, 6:21.
28. Kusradze I, Diene S.M, Goderdzishvili M, Rolain J.M (2018), “Molecular