Bên cạnh phát hiện sự có mặt của các gen kháng kháng sinh của vi khuẩn, việc tìm hiểu về trình tự của các gen để tìm ra những biến đổi cũng mang ý nghĩa lớn trong nghiên cứu. Sự phát triển của các phương pháp giải trình tự đã giúp các nghiên cứu giải quyết vấn đề này. Đối với việc phân tích các biến đổi trong trình tự DNA của A.
baumannii, chúng tơi đã lựa chọn phương pháp giải trình tự Sanger để xác định trình
tự các nucleotide trong sản phẩm PCR thu được. Phương pháp này thực hiện dựa trên kỹ thuật phổ biến là “chain termination- kết thúc chuỗi” bằng việc sử dụng các deoxy nucleotide đã bị chỉnh sửa làm mất nhóm hydroxyl ở đầu 3’ của phân tử đường. Nhóm 3’-OH đóng vai trị cho phép gắn thêm một nucleotide mới vào chuỗi. Khi một ddNTP được thêm vào chuỗi, vì khơng có nhóm 3’-OH nên một nucleotide khơng được thêm vào, phản ứng tổng hợp sẽ dừng lại. Enzyme polymerase xúc tác phản ứng gắn các dNTP vào mạch đơn của DNA để kéo dài mạch ở vị trí 3’- OH và dừng lại nếu gắn các ddNTP vào chuỗi. Trong một phản ứng chứa cả dNTP và ddNTP nên sau phản ứng tổng hợp, hình thành các đoạn DNA có độ dài khác nhau do ddNTP gắn ngẫu nhiên làm dừng phản ứng. Dựa vào sự sai khác về độ dài các đoạn DNA hiển thị trên bản gel sau điện di để xác định trình tự trong gene [82].
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.Đối tượng nghiên cứu
Mẫu bệnh phẩm đờm của bệnh nhân được thu thập, xử lý, nuôi cấy và xác định dương tính với A. baumannii. Các mẫu DNA được tinh sạch từ mẫu dương tính với
A. baumannii ở Khoa Vi sinh Bệnh viện Phổi Trung ương sau đó được chuyển về
Phịng Thí nghiệm Enzyme và phân tích hoạt tính sinh học để phân tích bằng kỹ thuật multiplex PCR và một số mẫu được giải trình tự.
2.2.Phương pháp nghiên cứu
Mẫu bệnh phẩm (đờm) của các bệnh nhân được xử lý và nuôi cấy theo quy trình để xác định sự có mặt của A. baumannii. Các mẫu dương tính với A. baumannii sẽ được tách DNA, 63 mẫu trong đó được chỉ định làm kháng sinh đồ theo yêu cầu của bác sĩ. Tất cả các mẫu DNA được tinh sạch từ mẫu dương tính với A. baumannii được tiến hành multiplex PCR với bốn gen đích bao gồm: OXA-23, OXA-51, VIM và
IMP. Các mẫu cần lưu ý được gửi đi giải trình tự. Các kết quả được phân tích và xử
lí số liệu theo đúng mục tiêu nghiên cứu của đề tài.
2.2.1. Nuôi cấy và định danh A. baumannii từ mẫu bệnh phẩm
2.2.1.1 Nguyên tắc
Mẫu bệnh phẩm (đờm) của các bệnh nhân được xử lý và thực hiện nuôi cấy phân lập vi khuẩn trên môi trường thạch máu, thạch Mac Conkey theo phương pháp bán định lượng và ủ ấm ở nhiệt độ 35 – 37oC (tủ ấm có 5 – 7 % CO2 cho đĩa thạch máu) theo đúng quy trình thường quy của Khoa vi sinh Bệnh viện Phổi Trung ương.
2.2.1.2 Hóa chất sinh phẩm
Bộ hóa chất nhuộm Gram, thạch máu cừu và thạch Mac Conkey được dùng để phân lập là nhuộm vi khuẩn. Khoanh giấy optochin, oxidase và kit API 20NE [76] được sử dụng trong các test thử sinh hóa định danh vi khuẩn.
2.2.1.3 Các bước tiến hành
Nuôi cấy vi khuẩn: Tiến hành nuôi cấy với các mẫu bệnh phẩm đạt chất lượng.
Các đĩa thạch được ghi số xét nghiệm, tên bệnh nhân, loại bệnh phẩm, ngày cấy. Dùng que tre vô trùng hoặc que cấy nhựa lấy mẫu đờm nhày mủ nhất, cấy vùng nguyên ủy vào 1 đĩa thạch máu, 1 đĩa thạch Mac Conkey. Mỗi đĩa thạch cấy 4 vùng
(chia đều nhau tương đối) để có khuẩn lạc tách riêng rẽ. Vùng 1: ria ở phần tư thứ 1. Vùng 2: ria 2 lần ở vùng 1 (sát rìa của đĩa), ria nhiều đường sít nhau tạo vùng 2 (phần tư thứ 2). Vùng 3: ria 2 lần vùng 2, ria nhiều đường sít nhau tạo vùng 3 (phần tư thứ 3). Vùng 4: ria 2 lần vùng 3, ria nhiều đường sít nhau tạo vùng 4 (phần tư thứ 4).
Ủ ấm môi trường nuôi cấy vi khuẩn: Các đĩa thạch máu ủ ấm ở 37oC trong tủ
ấm CO2 (5- 7%). Các đĩa thạch Mac Conkey ủ ấm ở 37oC trong tủ ấm thường. Sau 16 - 24 giờ ủ ấm, kiểm tra khuẩn lạc nghi ngờ. Ủ tiếp 16 - 24 giờ (nếu khơng có khuẩn lạc nghi ngờ). Hủy đĩa thạch nếu sau 48 giờ không xuất hiện khuẩn lạc nghi ngờ.
Đọc và nhận định kết quả: Hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn được nhận định
trên môi trường thạch máu và thạch MacConkey dựa và sự quan sát hình dạng, kích thước, màu sắc, độ bóng hoặc khơ mỡ, bờ đều hay khơng đều, tính chất tan máu, mùi. Sau đó nhuộm gram để xác định hình thể, cách sắp xếp, tính chất bắt màu của vi khuẩn và định danh vi khuẩn bằng kit API 20 NE và chỉ trả kết quả khi có tỉ lệ tương đồng > 90%. Đọc phần khuyến cáo khi cần làm thêm các test định danh khác. Sau khi định danh, cấy chuyển khuẩn lạc sang đĩa thạch mới để chuẩn bị làm kháng sinh đồ ngày hôm sau. Thực hiện kháng sinh đồ đối với A. baumannii theo phương pháp khuếch tán trên thạch.
2.2.2. Tách DNA
Quy trình tách chiết DNA sử dụng bộ kit Genolyse (Hain Lifescience, Đức). Gặt đầy khuẩn lạc trên que cấy từ mơi trường ni cấy, hịa với 100 µl nước cất đựng trong tuýp 1,5 ml có nắp xốy. Sử dụng 100 µl hóa chất tách A. Lysis buffer bổ sung vào các mẫu thu được, vortex vài giây ở tốc độ cao. Ủ trong máy ủ nhiệt 950C/5 phút sau đó bổ sung thêm 100 µl hóa chất tách trung hòa, vortex vài giây ở tốc độ cao. Ly tâm 13.000 rpm/5 phút, hút 100 µl dịch nổi sang tube sạch, cất giữ ở tủ mát 2-80C. Nếu khơng sử dụng ngay để PCR thì nên cất vào tủ âm -200C.
2.2.3. Quy trình thực hiện kháng sinh đồ
Chuẩn bị đĩa thạch, khoanh giấy kháng sinh và chủng vi khuẩn nuôi cấy. Các đĩa thạch được ổn định ở nhiệt độ phòng khoảng 2 tiếng trước khi làm xét nghiệm. Các khoanh giấy kháng sinh được đậy nắp, lấy ra trước 15 phút để ở nhiệt độ phịng. Chủng vi khuẩn ni cấy đảm bảo độ tuổi 18-24 giờ nuôi cấy. Các khuẩn lạc được
lựa chọn trên đĩa thạch cấy chuyển là thuần khiết, giống nhau và riêng rẽ. Mỗi khuẩn lạc được hòa tan trong ống chứa 2 ml nước muối sinh lý, lắc đều bằng vortex. Sau đó, độ đục của vi khuẩn được điều chỉnh so với ống chuẩn Macfarland số 0,5 bằng máy đo độ đục. Huyền dịch vi khuẩn được ria trên mặt thạch bằng tăm bông. Các khoanh giấy kháng sinh được đặt lên đĩa thạch trong vịng 15 phút ngay sau đó. Các đĩa thạch được giữ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút cho kháng sinh từ các khoanh giấy khuếch tán trên mặt thạch. Các đĩa thạch được ủ trong 18-24 giờ. Kích thước vịng vơ khuẩn được đo và so sánh với đường kính vịng vơ khuẩn trong bảng danh mục kháng sinh để đánh giá theo các mức độ: nhạy cảm, trung gian hoặc đề kháng với kháng sinh đó.
Bảng 3: Bảng danh mục các kháng sinh được sử dụng làm kháng sinh đồ để đánh giá
mức độ nhạy cảm của Acinetobacter spp.
STT Kháng sinh Viết tắt Đường kính vịng vơ khuẩn (mm)
Kháng Trung gian Nhạy cảm
1 Doripenem 10 µg IMP ≤14 15-17 ≥18 2 Imipenem 10 µg DOR ≤18 19-21 ≥22 3 Meropenem 10 µg MEM ≤14 15-17 ≥18 4 Ceftazidime 30 µg CAZ ≤14 15-17 ≥18 5 Ceftriaxone 30 µg CRO ≤13 14-20 ≥21 6 Cefepime 30 µg CPM ≤14 15-17 ≥18
7 Ticarcillin + Acid clavulanic
75/10 µg TCC ≤14 15-19 ≥20 8 Piperacillin + Tazobactam 100/10 µg TZP ≤17 18-20 ≥21 9 Tobramycin 10 µg TM ≤12 13-14 ≥15 10 Amikacin 30 µg AK ≤14 15-16 ≥18=7 11 Ciprofloxacin 5 µg CIP ≤15 16-20 ≥21 12 Levofloxacin 5 µg LVX ≤13 14-16 ≥17 13 Minocycline 30 µg MNO ≤12 13-15 ≥16 14 Doxycycline 30 µg DO ≤9 10-12 ≥13
2.2.4. Multiplex PCR
2.2.4.1 Hóa chất, thiết bị
Các hóa chất chính được sử dụng trong đề tài bao gồm các hóa chất dùng cho phản ứng PCR bao gồm: dNTP, Green Taq buffer, enzyme Dream Taq polymerase (Thermo Scientific, Mỹ), DMSO (Merck), nước tinh khiết deion và các cặp mồi đặc hiệu. Sản phẩm được điện di trên gel agarose 2-3% (Clever Scientific, Anh) và sử dụng thuốc nhuộm RedSafe (Intron Biotechnology, Hàn Quốc).
Thiết bị chính bao gồm: Thiết bị nhân gen GenAtlas (Astec, Nhật Bản). Bộ điện di ngang (Bio-Rad, Mỹ). Hệ thống soi gel và chụp hình GelDoc (Bio-Rad, Mỹ)
2.2.4.2 Tối ưu hóa phản ứng multiplex PCR
Quy trình phản ứng multiplex PCR đã được tối ưu hóa các thành phần phản ứng và chu trình nhiệt. Kết quả tối ưu của nhóm nghiên cứu đã được cơng bố trên tạp chí Vietnam Journal of Science, Technology and Engineering Vol 61 (No. 1) (2019) (trang 58-61).
2.2.4.3 Các cặp mồi sử dụng
Phản ứng PCR đa mồi khuếch đại đồng thời các đoạn trình tự DNA đích, các cặp mồi đặc hiệu được chọn để nhân lên các đoạn trình tự đích có kích thước khác nhau, có thể phân tách rõ khi điện di.
Bảng 4: Trình tự các cặp mồi cho các gen OXA-23, OXA-51, VIM và IMP
STT Gen đích Cặp mồi (5’-3’) Sản phẩm (bp)
1 OXA-23 Fw – GAT CGG ATT GGA GAA CCAGA Rv – ATT TCT GAC CGC ATT TCC AT [53]
501
2 OXA-51 Fw – TAA TGC TTT GATCGG CCT TG Rv – TGG ATT GCA CTT CAT CTT GG [53]
353
3 VIM Fw – GATGGTGTTTGGTCGCATA
Rv – CGAATGCGCAGCACCAG [35]
390
4 IMP Fw – GGAATAGAGTGGCTTAAYTCTC
Rv – CCA AAC YAC TAS GTT ATC T [35]
188
2.2.4.4 Thành phần phản ứng
Bảng 5: Các thành phần tham gia phản ứng Multiplex PCR
Tên thành phần Nồng độ/thể tích
Khn DNA 2 µl
dNTP 0,3 mM
Green Taq Buffer 2X
Enzyme Dream Taq polymerase 0,5U
Mồi F/R OXA-23 0,2 µM OXA-51 0,2 µM VIM 0,3 µM IMP 0,4 µM DMSO 8 %
Nước tinh khiết khử ion vừa đủ 12,5 µl
2.2.4.5 Chu trình nhiệt
Phản ứng multiplex PCR thực hiện với chu trình nhiệt: 5 phút khởi đầu ở 940C, giai đoạn tiếp theo gồm 30 chu kỳ (940C/30 giây; 500C/45 giây; 720C/50 giây), giai đoạn kết thúc ở 720C/5 phút. Và giữ lạnh ở 40C (nếu chưa điện di ngay). (Hình 7)