Tuy có sự khác nhau trong tỷ lệ nhưng sự chênh lệch không quá cao (0,8 % - 4,7 %), điều cho vẫn cho thấy rằng các chủng A. baumannii thu được tại Bệnh viện phổi Trung Ương có mức độ kháng cao với các carbapenem trong nghiên cứu. Từ kết quả điều tra cho thấy những chủng nhạy cảm với carbapenem chiếm chưa tới 10%. Khi so sánh với các nghiên cứu tại các bệnh viện khác trong cả nước, kết quả này chỉ ra tỷ lệ kháng cao hơn so với các nghiên cứu trong nước như: nghiên cứu của Phạm Thị Quỳnh (2017) tại Bệnh viện Bạch Mai với tỷ lệ A. baumannii kháng carbapenem là 83,3%, nghiên cứu của Trần Diệu Linh (2015 – 2017) tại Bệnh viện Trung Ương 108 và Bệnh viện Việt Đức (92,2%) [71], nghiên cứu của Lê Nữ Xuân Thanh tại Bệnh viện Trung Ương Huế và bệnh viện Đại học Y Dược Huế (88,3 %) [63]. Một nghiên cứu khác lại cho thấy vi khuẩn A. baumannii có mức đề kháng kháng sinh rất cao hơn trong nghiên cứu của chúng tôi, lên đến 97% ở bệnh viện Phạm Ngọc Thạch [70].
Tình trạng kháng carbapenem ở mức độ cao của A. baumannii trong hầu khắp các bệnh viện ở Việt Nam trong giai đoạn từ 2009-nay đã được tổng hợp trong các nghiên cứu của Li-Yang Hsu (2016) về tình trạng kháng carbapenem ở khu vực Nam Á và Đông Nam Á [26] và càng được củng cố với kết quả nghiên cứu của chúng tôi tại Bệnh viện Phổi Trung ương, một bệnh viên chuyên khoa về viêm phổi, căn bệnh chiếm tỷ lệ cao nhất trong nhiễm khuẩn bệnh viện. Chính điều này đã đưa Việt Nam trở thành một trong những quốc gia nằm trong trạng thái báo động cao nhất về tình trạng kháng thuốc nói chung và carbapenem nói riêng.
3.2.2. Các nhóm beta-lactam khác
Ngoài các carbapenem trong nghiên cứu của chúng tơi cịn đánh giá mức độ kháng kháng sinh của các chủng A. baumannii thu được với các kháng sinh beta- lactam khác thuộc hai nhóm cephalosporin và penicillin. Kết quả cho thấy A. baumannii không chỉ thể hiện khả năng kháng cao với carbapenem mà với các beta-
lactam khác tỷ lệ này cũng đã vượt quá 90 % (Hình 11). Các kháng sinh trong nhóm cephalosporin bao gồm các kháng sinh thuộc thế hệ 3,4 bao gồm ceftazidime (CAZ), ceftriaxone (CRO), cefepime (CPM), tỷ lệ kháng với hai kháng sinh đầu tiên là 95 % và cao hơn với cefepime 97 %. Tỷ lệ này cao hơn hẳn với kết quả nghiên cứu của Shirin và cộng sự ở Malaysia khi hai kháng sinh cephalosporin được chỉ định kháng sinh đồ là ceftazidime và cefepim chỉ có mức độ kháng lần lượt là 76 % và 73 %. Đây đều là những kháng sinh thế hệ mới thuộc dòng cephalosporin và được chỉ định chủ yếu trong công tác điều trị các bệnh liên quan đến nhiễm khuẩn bệnh viện. Kết quả đánh giá với các kháng sinh thử nghiêm thuộc nhóm penicillin cũng khơng cho con số khả quan hơn, các tổ hợp penicillin và các chất ức chế beta-lactamase gần như đã thất bại hoàn toàn trong việc điều trị đối với A. baumannii, trong nghiên cứu của chúng tôi hai loại thuộc phối hợp thường được định bao gồm ticarcillin-clavulanic (TCC) và piperacillin-tazobactam (TZP) đã bị kháng với tỷ lện lần lượt là 96 % và 92 %. Kết quả này cũng khá phù hợp với nghiên cứu của Yunxing và cộng sự khi cho rằng OXA-23 chính là cơ chế phổ biến trong việc phân giải các chất ức chế beta- lactamase [56]
Như vậy trong nghiên cứu của chúng tôi các chủng A. baumannii thu được đều kháng cao với các beta-lactam bao gồm cả carbapenem, đây thực sự là một thách thức cho công tác điều trị đối với các bệnh nhiễm khuẩn trong bệnh viện đặc biệt là viêm phổi khi loại kháng sinh được đánh giá là an tồn, hiệu quả nhất đã khơng cịn có thể khống chế được tác nhân gây bệnh nguy hiểm này. Phổ kháng sinh lựa chọn để điều trị các bệnh liên quan tới A. baumannii đang ngày càng bị thu hẹp gây ra thách thức rất lớn trong việc điều trị và chỉ định kháng sinh đối với nhiễm khuẩn bệnh viện.
Hình 11: Mức độ kháng của A. baumannii với các kháng sinh nhóm beta-lactam
3.2.3. Các kháng sinh khác
Do khả năng kháng với các kháng sinh nhóm beta-lactam cao nên các mẫu cũng đã được chỉ định kháng sinh đồ với với các kháng sinh khác để tìm sự lựa chọn tốt nhất trong điều trị. Các kháng sinh bao gồm nhóm aminoglycoside (amikacin (AK) và tobramycin (TM)), nhóm quinonlon (levofloxacin (LVX), ciprofloxacin (CIP)), nhóm tetracycline (minocycline (MNO), doxycycline (DO)). Mức độ kháng của A.
baumannii đối với các nhóm kháng sinh này có sự khác biệt (Hình 12). Nhóm
aminoglycoside với đích tác động là tiểu phần ribosome 30s của vi khuẩn đã bị đề kháng trên 80 % với tỷ lệ lần lượt là 87 % và 89 % đối với tobramycin và amikacin. Đối với dòng kháng sinh quinolone mức độ đề kháng còn cao hơn, vượt quá 90 %, A.
baumannii đã kháng 95 % với ciprofloxacin và 94 % với levofloxacin. Tuy nhiên đối
với kháng sinh tetracycline kết quả có nhiều khả quan khi mà chỉ có 55 % doxycycline bị kháng và tỷ lệ kháng với minocycline chỉ có 25 %. Đây chính là một trong những gợi ý tích cực cho các bác sĩ trong công tác điều trị khi có thể lựa chọn nhóm tetracycline để điều trị các bệnh liên quan đến A. baumannii thay vì các loại kháng sinh khác.
Hình 12: Mức độ kháng của A. baumannii với một số kháng sinh khác
3.2.4. Đánh giá chung
Dựa trên tiêu chuẩn đánh giá mức độ kháng kháng sinh đối với A. baumannii, có 60/63 chủng A. baumannii thu được xếp vào mức độ đa kháng sinh (MDR), kháng ít nhất 1 kháng sinh trong 3 nhóm kháng sinh khác nhau, chiếm tới 95 %. Trong đó có 21/63 chủng kháng toàn bộ các kháng sinh thử nghiệm, những chủng này có khả năng nằm trong nhóm siêu kháng (XDR) hoặc thậm chí tồn kháng (PDR). Đồng thời có 3 mẫu chỉ kháng kháng sinh trong 1-2 nhóm, đây có thể là những chủng nhạy cảm. Tuy nhiên do các dữ liệu về kháng sinh đồ chưa đầy đủ theo đúng tiêu chuẩn đánh giá nên nhóm nghiên cứu chưa thể đưa ra kết luận cụ thể về khả năng kháng của các mẫu này trong các trường hợp nói trên. Trong thời gian tới việc tiến hành kháng sinh đồ đầy đủ theo đúng tiêu chuẩn đánh giá mức độ nhạy cảm của A. baumannii là rất cần thiết để có thể đưa ra tầm nhìn tổng qt hơn về các chủng A. baumannii đang lưu hành tại Việt Nam.
3.3. So sánh kết quả sự có mặt của các gen và khả năng kháng kháng sinh dựa trên kháng sinh đồ và xác định mối liên quan.
Kết hợp tần suất xuất hiện của các gen đích và kết quả kháng sinh đồ của carbapenem chúng tôi thu được bảng tổng hợp sau:
Bảng 9: Kết quả PCR và kháng sinh đồ của các mẫu A. baumannii
PCR Kết quả kháng sinh đồ
OXA 23 OXA 51 VIM IMP IMP DOR MEM
24 - + - - 25 - + - - 30 + + - - 31 + + - - 32 - + - - 33 + + - - 35 - + - - 39 + + - - 42 + + - - 43 + + - - 44 + + - - 45 + + - - 46 + + - - 47 + + - - 48 + + - - 49 + + - - 50 - + - - 51 + + - - 52 + + - - 53 + + - - 54 + + - - 56 + + - - 57 + + - - 58 + + - - 59 + + - - 60 + + - - 61 + + - - 62 + + - - 63 - - - - 64 - - - - 65 + + - - 66 + + - - 67 + + - -
*Chú thích: (+) xuất hiện gen; (-) khơng xuất hiện
Kháng Trung gian Nhạy cảm Khơng có thơng tin
Kết quả đánh giá mối tương quan giữa khả năng kháng carbapenem với sự có mặt của bốn gen đích mã hóa carbapenemase cho thấy ở những chủng mang hai gen
OXA-23 và OXA-51 kháng 100% với các kháng sinh carbapenem thử nghiệm. Trong
tổng số 63 chủng vi khuẩn A. baumannii được chỉ định kháng sinh đồ có 10 chủng chỉ mang gen OXA-51 với mức độ kháng với mỗi loại kháng sinh ở mỗi chủng là khác nhau (Bảng 10). Trong đó, 5 chủng là kháng hồn tồn với hai kháng sinh imipenem
68 + + - - 69 + + - - 70 + + - - 71 + + - - 72 + + - - 73 + + - - 74 + + - - 75 - + - - 76 + + - - 78 + + - - 79 + + - - 80 + + - - 81 - + - - 83 + + - - 84 + + - - 85 - - - + 86 - - - - 87 + + - - 89 + + - - 90 + + - - 91 + + - - 92 + + - - 93 + + - - 94 + + - - 95 - + - - 96 - - - + 97 + + - - 98 + + - - 99 - + - - 100 - + - -
và meropenem (khơng có thơng tin về doripenem). Trong các chủng cịn lại có thử nghiệm với doripenem thì một chủng nhạy cảm và một chủng là kháng trung gian. Từ đây chúng ta có thể thấy sử dụng imipenem có thể cho kết quả tốt hơn ở những chủng này.
Như đã phân tích ở mục 3.1 sự xuất hiện phổ biến và khả năng tạo ra sản phẩm thủy phân mạnh đối với carbapenem đã đưa OXA-23 trở thành cơ chế chính kháng carbapenem của A. baumannii. Dựa vào kết quả của bảng tổng hợp nghiên cứu, chúng tôi càng khẳng định giả thiết này. Trong các mẫu khơng có sự xuất hiện của gen OXA-
23 bao gồm 24,25,32,50,86,99 kết quả kháng sinh đồ cho thấy khả năng nhạy cảm
cao hơn với các carbapenem thử nghiệm từ nhạy cảm đến mức độ kháng trung gian thay vì kháng hồn tồn như các mẫu có OXA-23. Tuy nhiên do việc thực hiện kháng sinh đồ chưa tồn diện, một số mẫu khơng có gen OXA-23 nhưng lại thiếu thơng tin về mức độ với doripenem nên mối liên hệ này còn chưa được khẳng định đối với các mẫu này. Có hai trường hợp ngoại lệ trong bảng tổng hợp trên cần được xem xét đó là mẫu 63, 64 cả hai mẫu này đều không phát hiện gen OXA-23 nhưng kháng tồn bộ 3 carbapenem điều này khiến chúng tơi nghĩ đến sự tồn tại của một cơ chế kháng kháng ngoài beta-lactamase đối với các chủng này hoặc do sự có mặt của một gen thuộc phân lớp khác. Tuy nhiên sự kết hợp đồng thời giữa OXA-51 với OXA-23 có thể đã làm tăng tính kháng của A. baumannii (thành 100%). Như vậy định hướng cho nhóm nghiên cứu trong tương lai là tiếp tục lựa chọn phát hiện các gen liên quan đến khả năng kháng kháng sinh khác kết hợp với các cơ chế ngoài sản xuất enzyme carbapenemase.
Hai metallo-beta-lactamase IMP, VIM trong nghiên cứu của chúng tơi thu
được đều có tần suất xuất hiện thấp điều này gây ra khó khăn trong việc xác định mối tương quan của các gen này với khả năng kháng carbapenem, mặc dù cả hai mẫu của sự xuất hiện của IMP đều kháng hồn tồn với imipenem và meropenem.
3.4. Phân tích trình tự một số mẫu để khẳng định độ chính xác của phương pháp và tìm hiểu sự khác biệt giữa các chủng thu được và một số chủng khác trên và tìm hiểu sự khác biệt giữa các chủng thu được và một số chủng khác trên thế giới.
3.4.1. Phân tích trình tự nhằm khẳng định độ chính xác của phương pháp
Để khẳng định kết quả của phương pháp sản phẩm PCR được kiểm tra một lần nữa bằng phản ứng PCR đơn mồi với các cặp mồi đặc hiệu. Ảnh điện di của phản ứng PCR đều xuất hiện các băng đặc hiệu. Vì vậy, các sản phẩm PCR được gửi đi giải trình tự cùng với mồi xi và mồi ngược của từng gen liên quan. Trình tự gen được đọc và tìm đầy đủ dựa trên kết quả giải trình tự bằng phần mềm Snap Gene (Hình 13). Kết quả thu được của các trình tự đích được lựa chọn của hai gen OXA-
23, OXA-51 khi so sánh trên ngân hàng gen đều thu được kết quả tương đồng 99%-
100% với nhiều chủng ứng với loài vi khuẩn này (Hình 14). Như vậy phản ứng multiplex PCR đã được tối ưu hóa đảm bảo nhân lên được chính xác các gen đích.
Hình 13
A: Kết quả giải trình tự gen OXA-51 với mồi ngược. B: So sánh kết quả giải trình tự với ngân hàng gen
3.4.2. Phân tích những biến đổi trong trình tự của các chủng thu được và một số chủng khác trên thế giới. chủng khác trên thế giới.
Nhóm nghiên cứu lựa chọn một số chủng dù chỉ mang gen mã hóa carbapenemase OXA-51 nhưng vẫn nhạy cảm với carbapenem để đi giải trình tự nhằm phát hiện sự khác biệt trong cấu trúc chuỗi cũng như so sánh về mức độ tương đồng so với các chủng tham chiếu và các chủng khác trên thế giới.
Bảng 10: Kết quả PCR và kháng sinh đồ một số chủng đem giải trình tự
STT Kết quả PCR Kết quả kháng sinh đồ
OXA-23 OXA-51 VIM IMP IMP DOR MEM
24 - + - -
25 - + - -
32 - + - -
35 - + - -
50 - + - -
Các đoạn trình tự OXA-51 ở các chủng 24, 25, 32, 35, 50 được lựa chọn giải trình tự. Kết quả cho thấy có 17 vị trí có sự thay đổi nucleotide so với gen tham chiếu. Tuy nhiên chỉ có 6 vị trí thay đổi dẫn đến sự thay đổi của acid amin (Bảng 12). Các vị trí cịn lại khơng có sự thay đổi là do tính thối hóa của mã bộ ba.
Bảng 11: Sự thay đổi nucleotide và acid amin so với trình tự tham chiếu
Vị trí nucleotide Các thay đổi về nucleotide Các thay đổi về acid amin
294 CT Giữ nguyên
301 GA (101) valineisoleusine
315 CT Giữ nguyên
318 GT Giữ nguyên
319 CA Giữ nguyên
328 CT (107) glutaminlysine
330 AG Giữ nguyên
349 GA (117) acid asparaginic
asparagine
366 TC Giữ nguyên
369 TC Giữ nguyên
390 GA Giữ nguyên
426 AG Giữ nguyên
438 GT (146) lysineasparagine
540 GA Giữ nguyên
581 C A (194) proline glutamine
587 TC (196) valine alanine
Tất cả các chủng đều có mức tương đồng cao (lớn hơn 97%) so với gen tham chiếu. Chủng số 50 tương đồng ở mức cao nhất (99,1%). Tiếp theo đó là chủng số 32 có mức tương đồng là 98,9%; chủng số 24, 25 đều có mức tương đồng là 98,6% và cuối cùng là chủng số 35 có mức tương đồng 97,7%. (Hình 14)