(M: Marker 100bp; (-): Đối chứng âm; 1,2,3,4: Các mẫu DNA)
Thống kê kết quả PCR của 100 mẫu cho thấy sự chiếm ưu thế của các beta- lactamase thuộc phân lớp D với OXA-51 là 88 % và OXA-23 là 77 %. Trong khi các gen thuộc phân lớp B lại xuất hiện với tần suất khá thấp 5 % đối với IMP và chỉ có duy nhất một mẫu xuất hiện VIM chiếm tỷ lệ 1 % (Hình 9).
Hình 9: Biểu đồ tỷ lệ phần trăm của các gen nghiên cứu
Kết quả này cũng trùng khớp với các nghiên cứu trong và ngoài nước khác khi tỷ lệ của các gen OXA thường chiếm ưu thế, đặc biệt là OXA-51. (Bảng 6)
Bảng 6: Thống kê tần suất xuất hiện gen OXA-51 trên thế giới và Việt Nam
Địa điểm nghiên cứu Năm công bố Tỷ lệ xuất hiện gen
OXA-51 (%) Tài liệu tham khảo Trên thế giới Ba Lan 2012 63,9 [41] Thổ Nhĩ Kỳ 2006 77,8 [51] 2015 100 [3] Malaysia 2015 97,0 [10] Iran 2013 100 [36] Pakistan 2014 100 [23] Trung Quốc 2015 92,3 [31] 2015 48,4 [25]
Tại Việt Nam
Bệnh Viện Trung Ương Huế 2017 100 [63]
Bệnh viện Đại học Y Dược Huế 2017 100 [63]
Bệnh viện Phổi Trung Ương * 2019 88,0
*: Kết quả của nghiên cứu này.
88%
77%
5%
1%
Kết quả cho thấy các nghiên cứu tại châu Âu cho tỷ lệ xuất hiện của gen OXA-
51 là trên 60 % còn các nghiên cứu tại châu Á cho thấy tỷ lệ đã lên tới hơn 90 % ngoại trừ nghiên cứu tại Trung Quốc của Hou và Yang [25]. Tỷ lệ OXA-51 cao có thể giải thích bằng chính vị trí của gen trong nhiễm sắc thể của A. baumannii, đây là gen tự nhiên sẵn có của A. baumannii, chúng được tìm thấy ngay trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn này và được phân lập lần đầu tiên vào năm 1996 tại Argentina. Chính vì bản chất là gen tự nhiên nên một số nghiên cứu thậm chí đã sử dụng OXA-51 như một gen dùng để định danh A. baumannii [50]. Tuy nhiên theo những số liệu đã nêu ở trên tỷ lệ xuất hiện OXA-51 khơng hồn tồn đồng nhất ở các nghiên cứu và khoảng chênh lệch giữa các nghiên cứu có thể lên tới hơn 40 %, đặc biệt trong nghiên cứu Hou và Yang tần suất phát hiện của gen OXA-51 chỉ là 48,4 % [25].
Mặc dù vậy, kết quả trên cũng không mâu thuẫn với bản chất gen tự nhiên của
OXA-51 mà được giải thích bằng tính đa hình của gen. Số lượng lớn các biến thể của OXA-51 đã làm cho OXA-51 trở thành một họ gen với nhiều gen biến thể khác nhau.
Sự hình thành các biến thể này là do áp lực của quá trình chọn lọc tự nhiên, xuất phát từ việc lựa chọn và sử dụng kháng sinh khác nhau ở các bệnh viện khác nhau trong một nước, trong các khu vực địa lý và trên thế giới. Các nghiên cứu tại Việt Nam cũng đã góp phần chứng minh điều này. Số liệu của nghiên cứu này được thống kê trên 100 mẫu thu thập tại Bệnh viện Phổi Trung Ương chỉ cho tần suất xuất hiện của
OXA-51 là 88 %, tuy nhiên nghiên cứu của Lê Nữ Xuân Thanh và cộng sự tại hai
bệnh viện Trung Ương Huế và bệnh viện Đại học Y Dược Huế trên 90 mẫu thu thập được phát hiện 100 % gen OXA-51 trong các mẫu [63].
Theo kết quả đề tài thu được, bên cạnh sự chiếm ưu thế của OXA-51, một gen khác trong phân lớp D là OXA-23 cũng cho thấy tần suất xuất hiện cao (77%). Tuy nhiên, trái với OXA-51 là gen tự nhiên nằm trên nhiễm sắc thể của A. baumannii, OXA-23 được định vị trên plasmid, chính vì vậy gen này có khả năng chuyển ngang
giữa các chủng vi khuẩn khác nhau. OXA-23 được tìm thấy ở nhiều lồi Acinetobacter và ở cả các vi khuẩn trong họ Enterobacteriaceae [52].
Nếu như dược động học của enzyme mã hóa với OXA-51 có tính chất thủy phân yếu đối với các carbapenem thì dược động học của enzyme do OXA-23 mã hóa
lại tương đối cao. Sản phẩm mã hóa bởi một mình gen OXA-23 của A. baumannii là đủ để tạo ra sự đề kháng với carbapenem. Một nghiên cứu của Claire và cộng sự (2005) đã cho thấy rằng, khi một vector plasmid có số lượng bản sao thấp mang gen
OXA-23 được sao chép vào một chủng A. baumannii, MIC của các carbapenem tăng
từ 0,25 lên 16 µg/ml, điểm dừng để xem xét các chủng kháng thuốc [24]. Còn khi một chủng mang gen OXA-23 đồng thời kết hợp với sự biểu hiện bơm đẩy thuốc AdeABC, MIC được tăng lên lớn hơn 32 µg/ml. Điều này chỉ ra rằng, khơng giống
như một số carbapenemase khác thuộc nhóm OXA, các chủng mang gen OXA-23
không yêu cầu hoạt động phối hợp các cơ chế kháng thuốc khác để kháng carbapenem, mặc dù mức độ kháng thuốc cao hơn được khi có các cơ chế khác tham gia. Cũng như các nghiên cứu đối với OXA-51, các nghiên cứu xác định sự có mặt của OXA-23 trên thế giới và Việt Nam cũng cho tỷ lệ cao trên 50 %. Đặc biệt nhiều nghiên cứu ở châu Á đã cho tỷ lệ lên tới 100 %. (Bảng 7)
Bảng 7: Thống kê tần suất xuất hiện gen OXA-23 trên thế giới và Việt Nam
Địa điểm nghiên cứu Năm công bố Tỷ lệ xuất hiện gen
OXA-23 (%) Tài liệu tham khảo Trên thế giới Brazil 2016 51,2 [39] Serbi 2015 57,1 [40] Qatar 2016 100 [47] Ấn Độ 2013 100 [1] Nepal 2017 100 [27]
Tại Việt Nam
Bệnh Viện Trung Ương Huế 2017 100 [63]
Bệnh viện Đại học Y Dược Huế 2017 100 [63]
Bệnh viện Việt Đức và Bệnh viện
Trung Ương Quan đội 108 2018 45,0 [71]
Bệnh viện Phổi Trung Ương * 2019 77,0
Các nghiên cứu trong nước về OXA-23 cũng cho tỷ lệ xuất hiện cao ở các mức độ khác nhau. Nghiên cứu của chúng tơi tìm thấy 77 % gen OXA-23 trong các mẫu thử nghiệm, trong khi đó Lê Nữ Xuân Thanh và cộng sự lại phát hiện sự có mặt của
OXA-23 tới 85,3 % [63] và gần đây nhất là nghiên cứu của Trần Diệu Linh đưa ra tỷ
lệ lên tới 45 % tìm thấy OXA-23 ở A. baumannii và đây là gen phổ biến nhất trong kết quả của tác giả đối với các vi khuẩn Gram (-) được nghiên cứu [71]. Sự xuất hiện phổ biến và khả năng tạo ra sản phẩm thủy phân mạnh đối với carbapenem đã đưa
OXA-23 trở thành cơ chế chính kháng carbapenem của A. baumannii, đặc biệt là đối
với khu vực Châu Á. Để khẳng định chắc chắn hơn điều này, chúng tôi đã thực hiện phân tích mối tương quan giữa tần suất xuất hiện của OXA-23 và mức độ kháng
carbapenem dựa trên kháng sinh đồ. Kết quả sẽ được trình bày ở mục 3 của chương này.
Ngoài các gen nằm trong phân lớp D, hiện nay các metallo-beta-lactamase (MBL) cũng đang là nhóm gen được cho là liên quan đến khả năng kháng carbapenem mạnh ở A. baumannii. MBL thường được mã hóa trên các gen cassette nằm trong các integron và dễ dàng lan truyền giữa các chủng A. baumannii. Tuy nhiên so với các nghiên cứu về các gen thuộc phân lớp D, các metallo-beta-lactamase thuộc phân lớp B cịn ít được đề cập đến. Chính vì vậy trong nghiên cứu này chúng tơi cũng đã lựa chọn 2 gen ở nhóm này để nghiên cứu bao gồm IMP và VIM. Tuy nhiên tần suất xuất hiện của hai gen này khá thấp, dưới 10 %, trong đó mẫu VIM chỉ xuất hiện duy nhất một lần và IMP là 5/100 mẫu. So sánh với các nghiên cứu khác trên thế giới thì tỷ lệ này thấp hơn đáng kể mặc dù bản thân các gen thuộc phân lớp B cũng được coi là nhóm gen khơng xuất hiện với tần suất cao. Một nghiên cứu ở Iran của Mansour và cộng sự đã thu được kết quả với 13,0 % IMP và 22,1 % VIM [2]. Trong khi đó nghiên cứu tại Ai Cập của Naswa và cộng sự lại thu được đến 95 % IMP nhưng không nhận được bất kỳ mẫu nào có VIM [4]. Các nghiên cứu khác ở Việt Nam về các gen thuộc nhóm này cũng hạn chế về số lượng. Tuy nhiên các nghiên cứu gần đây cho kết quả tương đối tương đồng với nghiên cứu của tôi. Cũng trong nghiên cứu của Lê Nữ Xuân Thanh và cộng sự tại hai bệnh viện tại Huế tỷ lệ IMP được tìm thấy là 4,4 % và và
VIM cũng không xuất hiện trong bất cứ mẫu A. baumannii phân lập nào còn IMP chỉ
xuất hiện với tần suất là 1/330 mẫu chiếm chưa đến 1 % [71]. Mặc dù được nhận định là có liên quan đến khả năng kháng carbapenem tuy nhiên với tần số xuất hiện q thấp rất khó để tìm được mối liên hệ của nhóm gen này với mức độ kháng kháng sinh của A. baumannii.
Đối với kết quả của 10 mẫu không xuất hiện bất cứ gen nào chúng tôi đã đưa ra giả thiết rằng phản ứng PCR đa mồi có thể khơng đặc hiệu, vì vậy chúng tôi đã tiến hành kiểm tra lại bằng PCR đơn mồi với tỷ lệ khuôn tăng gấp đôi tuy nhiên kết quả khơng thay đổi chính vì vậy chúng tơi đã đưa ra kết luận rằng có thể 10 mẫu đó khơng mang bất cứ gen mục tiêu nào hoặc số lượng bản copy là quá nhỏ chưa đủ để lên băng điện di. Trong những nghiên cứu tiếp theo việc xác định giới hạn phát hiện là cần thiết để đánh giá độ nhạy của phương pháp. Ngồi ra việc tiến hành phát hiện có thể được phát triển trên các kỹ thuật nhạy hơn của Real-time PCR hoặc LAMP để có kết quả chính xác hơn với nhưng mẫu mà nồng độ DNA thu được là khơng cao.
3.1.2 Sự có mặt của các tổ hợp gen.
Ngoài việc thống kê tần suất của từng gen, trong nghiên cứu của chúng tơi các gen đích cịn được phân tích tần suất theo các tổ hợp. Các gen không chỉ xuất hiện đơn lẻ mà cịn có thể xuất hiện đồng thời các tổ hợp 2 gen, 3 gen, 4 gen (Bảng 8). Kết quả cho thấy chỉ có một mẫu duy nhất mang tổ hợp 4 gen (1%), hai mẫu mang tổ hợp 3 gen (OXA-51, OXA-23, IMP), tổ hợp 2 gen chiếm 68% và tất cả các tổ hợp 2 gen đều là OXA-23 và OXA-51. Có 19 mẫu (19%) chứa gen carbapenemase đơn (OXA-
51 chiếm 17% và IMP chiếm 2 %) và có 10 mẫu khơng phát hiện được bất kì gen nào
(10%). Việc cùng xuất hiện với tần số cao của hai gen OXA-23 và OXA-51 đã làm cho tổ hợp 2 gen chiếm ưu thế hồn tồn nhưng khơng có mẫu nào trong 100 mẫu có sự xuất hiện riêng lẻ của OXA-23 và thay vào đó OXA-23 ln ln xuất hiện đồng thời với OXA-51.
Bảng 8: Tổng hợp các tổ hợp gen đích
* Các gen đơn cụ thể dùng để đối chiếu
3.2. Phân tích mức độ kháng kháng sinh của các mẫu A. baumannii thu được.
Trong 100 mẫu nghiên cứu, có 63 mẫu đã được thực hiện kháng sinh đồ với các kháng sinh chỉ định thuộc các nhóm: carbapenem, cephalosporin, aminoglycoside, quinolone và tetracyclin.
3.2.1. Khả năng kháng beta-lactam carbapenem.
Từ kết quả kháng sinh đồ cho thấy các chủng A. baumannii thu được đã kháng ít nhất một trong các kháng sinh carbapenem nghiên cứu bao gồm: imipenem (IMP), doripenem (DOR) và meropenem (MEM). Mức độ kháng lần lượt là meropenem với 60/63 chủng kháng chiếm tỉ lệ 95, 2%, sau đó đến doripenem là 91,3% (21/23) và cuối cùng là imipenem với mức độ kháng thấp hơn (57/63 chủng) (90,5%) (Hình 10). Trong số 23 chủng có đầy đủ kết quả kháng sinh đồ với cả 3 kháng sinh imipenem, doripenem và meropenem có 21 chủng kháng 100% với cả ba kháng sinh, 1 chủng kháng trung gian với doripenem và meropenem, duy nhất có 1 chủng nhạy cảm với cả ba kháng sinh.
Tổ hợp các gen đích Số lượng mẫu
Tổ hợp 4 gen 1
Tổ hợp 3 gen (OXA-23 + OXA-51 + IMP) 2
Tổ hợp 2 gen (OXA-23 + OXA-51) 68
Gen đơn OXA-51* 17
Gen đơn IMP* 2
Hình 10: Tỷ lệ % kháng carbapenem của các mẫu A. baumannii nghiên cứu
Tuy có sự khác nhau trong tỷ lệ nhưng sự chênh lệch không quá cao (0,8 % - 4,7 %), điều cho vẫn cho thấy rằng các chủng A. baumannii thu được tại Bệnh viện phổi Trung Ương có mức độ kháng cao với các carbapenem trong nghiên cứu. Từ kết quả điều tra cho thấy những chủng nhạy cảm với carbapenem chiếm chưa tới 10%. Khi so sánh với các nghiên cứu tại các bệnh viện khác trong cả nước, kết quả này chỉ ra tỷ lệ kháng cao hơn so với các nghiên cứu trong nước như: nghiên cứu của Phạm Thị Quỳnh (2017) tại Bệnh viện Bạch Mai với tỷ lệ A. baumannii kháng carbapenem là 83,3%, nghiên cứu của Trần Diệu Linh (2015 – 2017) tại Bệnh viện Trung Ương 108 và Bệnh viện Việt Đức (92,2%) [71], nghiên cứu của Lê Nữ Xuân Thanh tại Bệnh viện Trung Ương Huế và bệnh viện Đại học Y Dược Huế (88,3 %) [63]. Một nghiên cứu khác lại cho thấy vi khuẩn A. baumannii có mức đề kháng kháng sinh rất cao hơn trong nghiên cứu của chúng tôi, lên đến 97% ở bệnh viện Phạm Ngọc Thạch [70].
Tình trạng kháng carbapenem ở mức độ cao của A. baumannii trong hầu khắp các bệnh viện ở Việt Nam trong giai đoạn từ 2009-nay đã được tổng hợp trong các nghiên cứu của Li-Yang Hsu (2016) về tình trạng kháng carbapenem ở khu vực Nam Á và Đông Nam Á [26] và càng được củng cố với kết quả nghiên cứu của chúng tôi tại Bệnh viện Phổi Trung ương, một bệnh viên chuyên khoa về viêm phổi, căn bệnh chiếm tỷ lệ cao nhất trong nhiễm khuẩn bệnh viện. Chính điều này đã đưa Việt Nam trở thành một trong những quốc gia nằm trong trạng thái báo động cao nhất về tình trạng kháng thuốc nói chung và carbapenem nói riêng.
3.2.2. Các nhóm beta-lactam khác
Ngồi các carbapenem trong nghiên cứu của chúng tơi cịn đánh giá mức độ kháng kháng sinh của các chủng A. baumannii thu được với các kháng sinh beta- lactam khác thuộc hai nhóm cephalosporin và penicillin. Kết quả cho thấy A. baumannii không chỉ thể hiện khả năng kháng cao với carbapenem mà với các beta-
lactam khác tỷ lệ này cũng đã vượt quá 90 % (Hình 11). Các kháng sinh trong nhóm cephalosporin bao gồm các kháng sinh thuộc thế hệ 3,4 bao gồm ceftazidime (CAZ), ceftriaxone (CRO), cefepime (CPM), tỷ lệ kháng với hai kháng sinh đầu tiên là 95 % và cao hơn với cefepime 97 %. Tỷ lệ này cao hơn hẳn với kết quả nghiên cứu của Shirin và cộng sự ở Malaysia khi hai kháng sinh cephalosporin được chỉ định kháng sinh đồ là ceftazidime và cefepim chỉ có mức độ kháng lần lượt là 76 % và 73 %. Đây đều là những kháng sinh thế hệ mới thuộc dòng cephalosporin và được chỉ định chủ yếu trong công tác điều trị các bệnh liên quan đến nhiễm khuẩn bệnh viện. Kết quả đánh giá với các kháng sinh thử nghiêm thuộc nhóm penicillin cũng khơng cho con số khả quan hơn, các tổ hợp penicillin và các chất ức chế beta-lactamase gần như đã thất bại hoàn toàn trong việc điều trị đối với A. baumannii, trong nghiên cứu của chúng tôi hai loại thuộc phối hợp thường được định bao gồm ticarcillin-clavulanic (TCC) và piperacillin-tazobactam (TZP) đã bị kháng với tỷ lện lần lượt là 96 % và 92 %. Kết quả này cũng khá phù hợp với nghiên cứu của Yunxing và cộng sự khi cho rằng OXA-23 chính là cơ chế phổ biến trong việc phân giải các chất ức chế beta- lactamase [56]
Như vậy trong nghiên cứu của chúng tôi các chủng A. baumannii thu được đều kháng cao với các beta-lactam bao gồm cả carbapenem, đây thực sự là một thách thức cho công tác điều trị đối với các bệnh nhiễm khuẩn trong bệnh viện đặc biệt là viêm phổi khi loại kháng sinh được đánh giá là an tồn, hiệu quả nhất đã khơng cịn có thể khống chế được tác nhân gây bệnh nguy hiểm này. Phổ kháng sinh lựa chọn để điều trị các bệnh liên quan tới A. baumannii đang ngày càng bị thu hẹp gây ra thách thức rất lớn trong việc điều trị và chỉ định kháng sinh đối với nhiễm khuẩn bệnh viện.