Hình 15 : Mức độ tương đồng về acid amin
1.3. Các phương pháp nghiên cứu A baumannii
1.3.1. Phương pháp nuôi cấy
Nuôi cấy vi khuẩn là phương pháp kinh điển dựa trên sự phát triển của vi khuẩn trong các mơi trường thích hợp. Hầu hết các căn nguyên vi khuẩn thơng thường đều có thể phát triển dễ dàng trong các mơi trường rắn không chọn lọc như thạch máu, thạch chocolate. Những bệnh phẩm có tạp nhiễm nên được nuôi cấy trên các môi trường chọn lọc đặc biệt, đối với A. baumannii có thể sử dụng các mơi trường như MacConkey hoặc môi trường chọn lọc Leeds Acinetobacter [8]. Sau khi nuôi cấy trên môi trường chọn lọc, hầu hết các vi khuẩn sẽ phát triển và tạo thành khuẩn lạc sau 24-48 giờ, lúc này có thể sơ bộ định hướng loại tác nhân gây bệnh. Nhuộm Gram là phương pháp định danh sơ bộ, giúp phân biệt hai nhóm vi khuẩn khác nhau dựa
trên các đặc tính sinh hóa của thành tế bào vi khuẩn, vi khuẩn Gram (-) và vi khuẩn Gram (+). Nhuộm Gram có thể sử dụng bệnh phẩm là đờm, các dịch sinh học và mẫu mơ sinh thiết. Việc phân tích kết quả nhuộm Gram địi hỏi phải có kiến thức và kinh nghiệm về hệ vi sinh vật. Một mẫu đờm với sự xuất hiện của nhiều loại vi khuẩn hình thái khác nhau phù hợp với hệ vi sinh vật ở khoang miệng bình thường. [59]. Việc xác định chính xác loại vi khuẩn gây bệnh cịn phải dựa trên các hóa chất xác định tính chất sinh học, hóa học của vi khuẩn. Hiện nay trên thị trường nhiều test thử sinh hóa đã được thương mại hóa thuận tiện cho việc xác định nhiều loại vi khuẩn gây bệnh. Một trong các test sinh hóa thường được sử dụng hiện nay là các kit API của BioMérieux. Sau thời gian dài thử nghiệm các kit API đã được đánh giá là đáng tin cậy trong các nghiên cứu vi sinh. API 20E và API 20NE [76] là hai kit thử được sử dụng rộng rãi để xác định các vi khuẩn Gram (-) trong các phịng nghiên cứu vi sinh trong đó có A. baumannii. Ngoài các phương pháp định danh cổ điển, việc định danh vi sinh vật bằng dấu ấn phân tử Malditof cũng đang được ứng dụng rộng rãi trên toàn thế giới tại các viện nghiên cứu, bệnh viện và trung tâm y khoa hàng đầu hiện nay. Một ưu điểm vô cùng quan trọng của phương pháp nuôi cấy so với các phương pháp khác là sau khi phân lập và xác định chính xác vi khuẩn gây bệnh, người ta có thể tiến hành làm kháng sinh đồ để đánh giá tình trạng nhạy cảm hay đề kháng của vi khuẩn gây bệnh với các thuốc kháng sinh, từ đó sẽ hướng dẫn lựa chọn các kháng sinh thích hợp cho điều trị tối ưu. Các phương pháp xác định khả năng đề kháng của vi khuẩn thường được sử dụng như khuếch tán đĩa và E-test.
Khuếch tán đĩa dựa trên nguyên tắc đĩa tẩm kháng sinh, đặt trên mơi trường thạch trước đó đã được cấy vi khuẩn thử nghiệm, lấy độ ẩm và khuếch tán kháng sinh ra bên ngồi qua mơi trường thạch tạo ra gradient nồng độ kháng sinh. Nồng độ của kháng sinh ở rìa đĩa cao và giảm dần khi khoảng cách từ đĩa tăng lên đến một điểm nơi mà nó khơng cịn ức chế cho sinh vật, sau đó sinh vật phát triển tự do. Một vùng hoặc vịng rõ ràng được hình thành xung quanh đĩa kháng sinh sau khi ủ nếu tác nhân ức chế sự phát triển của vi khuẩn [59,68].
Phương pháp E-test là một phương pháp được thiết lập tốt để thử nghiệm độ nhạy cảm của thuốc kháng khuẩn trong các phịng thí nghiệm vi
sinh trên toàn thế giới. E-test bao gồm một dải nồng độ kháng sinh được xác định trước trên một dải nhựa và được sử dụng để xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của kháng sinh, thuốc chống nấm.[77]
1.3.2. Phương pháp sinh học phân tử
Hiện nay các phương pháp sinh học phân tử được sử dụng trong định danh vi khuẩn và hỗ trợ chuẩn đoán đang ngày càng phổ biến do thời gian phân tích ngắn và hiệu quả cao. Các phương pháp phổ biến thường gặp như PCR, LAMP, Real-time PCR.
LAMP là một phương pháp khuếch đại ADN mới, có độ đặc hiệu cao, bằng cách tận dụng ưu điểm một bộ mồi được thiết kế đặc biệt do vậy làm tăng độ nhạy cũng như độ nhanh của phản ứng. Phương pháp khuếch đại acid nucleic này diễn ra ở điều kiện đẳng nhiệt (trong khoảng 60-65˚C) cho phép phát hiện gen đích trong vòng một giờ, đơn giản về mặt thao tác. Lợi thế lớn của LAMP so với PCR truyền thống là độ nhạy cao (có thể gấp 10 lần) và cho kết quả nhanh (20-60 phút so với 2- 3 giờ PCR-điện di thông thường). Với những ưu điểm kể trên, LAMP có tiềm năng được ứng dụng ở các bệnh viện để phục vụ cho các xét nghiệm lâm sàng cần kết quả nhanh và chính xác [62]. Tuy nhiên do phương pháp có độ nhạy cao nên q trình thực nghiệm địi hỏi mức độ chính xác cao để tránh xảy ra hiện tượng dương tính giả. Phương pháp sinh học phân tử phổ biến nhất được sử dụng là PCR, được dùng để khuếch đại một đoạn DNA ngắn, đã xác định được một phần. Đó có thể là một gen đơn, hay một phần của gen. Bằng kỹ thuật PCR, từ một lượng khuôn DNA rất nhỏ có thể khuếch đại chính xác một lượng lớn lên đến hàng triệu bản copy nhằm phục vụ cho các quá trình khảo sát trong phản ứng. Đặc biệt, phương pháp PCR có độ nhạy đặc nhạy và độ đặc hiệu cao khi so sánh với phương pháp nuôi cấy (tiêu chuẩn vàng). Xét nghiệm bằng PCR cho kết quả chính xác cao hơn các phương pháp xét nghiệm truyền thống. Nó có thể giúp phát hiện ra nhiều loại vi khuẩn gây bệnh và tiết kiệm được nhiều thời gian hơn.
Hiện nay phương pháp PCR đã được phát triển thành nhiều kỹ thuật khác nhau, trong đó có PCR đa mồi (multiplex PCR) và Realtime PCR được sử dụng nhiều trong các nghiên cứu chẩn đốn. Trong phân tích PCR đa mồi, nhiều trình tự sẽ được
khuếch đại cùng lúc sử dụng nhiều cặp mồi, tất cả các thành phần được bổ sung vào cùng một ống phản ứng. Thiết kế mồi đặc hiệu là một trong những yếu tố quyết định đến sự thành công của phản ứng multiplex PCR. Quá trình thiết kế mồi liên quan đến chiều dài mồi, nhiệt độ nóng chảy của mồi, độ đặc hiệu và tránh hình thành dimer. Ngồi ra kỹ thuật multiplex PCR cịn địi hỏi quả trình tối ưu hóa các thành phần của phản ứng, thời gian, nhiệt độ gắn mồi để có thể xác định đồng thời nhiều gen với kết quả chính xác. Multiplex PCR được coi như một phương pháp cải tiến của phản ứng PCR thông thường, phương pháp này giúp rút ngắn thời gian thực hiện mà lại khơng ảnh hưởng tới kết quả thí nghiệm (Hình 6).
Đối với Realtime PCR, đây là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch đại DNA đích hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng, chính vì vậy nên được gọi là real- time. Với đặc điểm này khi thực hiện real-time người làm thí nghiệm khơng cần thiết phải làm tiếp các thí nghiệm đọc và phân tích kết quả để xác định có sản phẩm khuếch đại hay khơng vì kết quả cuối cùng của q trình khuếch đại cũng được hiển thị ngay sau khi phản ứng hoàn tất. Như vậy phương pháp này khơng những có thể dùng để định tính mà cịn có thể định lượng được số bản sao DNA có trong mẫu thử nghiệm [69].
Bên cạnh phát hiện sự có mặt của các gen kháng kháng sinh của vi khuẩn, việc tìm hiểu về trình tự của các gen để tìm ra những biến đổi cũng mang ý nghĩa lớn trong nghiên cứu. Sự phát triển của các phương pháp giải trình tự đã giúp các nghiên cứu giải quyết vấn đề này. Đối với việc phân tích các biến đổi trong trình tự DNA của A.
baumannii, chúng tơi đã lựa chọn phương pháp giải trình tự Sanger để xác định trình
tự các nucleotide trong sản phẩm PCR thu được. Phương pháp này thực hiện dựa trên kỹ thuật phổ biến là “chain termination- kết thúc chuỗi” bằng việc sử dụng các deoxy nucleotide đã bị chỉnh sửa làm mất nhóm hydroxyl ở đầu 3’ của phân tử đường. Nhóm 3’-OH đóng vai trị cho phép gắn thêm một nucleotide mới vào chuỗi. Khi một ddNTP được thêm vào chuỗi, vì khơng có nhóm 3’-OH nên một nucleotide khơng được thêm vào, phản ứng tổng hợp sẽ dừng lại. Enzyme polymerase xúc tác phản ứng gắn các dNTP vào mạch đơn của DNA để kéo dài mạch ở vị trí 3’- OH và dừng lại nếu gắn các ddNTP vào chuỗi. Trong một phản ứng chứa cả dNTP và ddNTP nên sau phản ứng tổng hợp, hình thành các đoạn DNA có độ dài khác nhau do ddNTP gắn ngẫu nhiên làm dừng phản ứng. Dựa vào sự sai khác về độ dài các đoạn DNA hiển thị trên bản gel sau điện di để xác định trình tự trong gene [82].
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.Đối tượng nghiên cứu
Mẫu bệnh phẩm đờm của bệnh nhân được thu thập, xử lý, ni cấy và xác định dương tính với A. baumannii. Các mẫu DNA được tinh sạch từ mẫu dương tính với
A. baumannii ở Khoa Vi sinh Bệnh viện Phổi Trung ương sau đó được chuyển về
Phịng Thí nghiệm Enzyme và phân tích hoạt tính sinh học để phân tích bằng kỹ thuật multiplex PCR và một số mẫu được giải trình tự.