CHƯƠNG II : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.3Phương pháp xác định peptaibol chứa trong dịch chiết thô
2.2 Vật liệu nghiên cứu
2.3.3Phương pháp xác định peptaibol chứa trong dịch chiết thô
Tiến hành theo Parisa et al. (2016). Các mẫu sau khi cô quay tiến hành hút 3 ml methanol và 3 ml chloroform thêm vào dịch thơ. Sau đó lọc phân đoạn tiếp tuyến qua màng Silica gel 60 (0,015 x 0,040 mm). Sử dụng 3 ml methanol và 3 ml chloroform để rửa màng lọc. Bảo quản dịch chiết khô bằng cách bổ sung vào 3 ml chloroform. Khi cần phân tích, rửa dịch chiết từ từ với 3 ml methanol/chloroform liên tiếp từ 0% đến 100% methanol 11 lần.
Các mẫu dịch chiết thô TC15 và TC25 sau khi tinh sạch được phân tích qua phổ IR cùng với alamethicin là một chất peptaibol chuẩn. Mẫu được chạy trên máy quét phổ UV – VIS, lượng mẫu cần thiết cho mỗi lần chạy là 2ml/mẫu. Các mẫu alamethicin và mẫu thí nghiệm được quét lần lượt từ 190 – 230nm. Các peak thu được được nhận diện bằng phần mềm UV winlab V6.04.
Dịch chiết thơ được gửi đến Phịng phân tích – Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Nơng nghiệp Cơng nghệ cao để xác định trình tự amino acid trong peptaibol.
Đầu tiên, các mẫu Trichobrachin tinh sạch TC15 và TC25 được phân tích và thu peak phân đoạn bằng hệ thống HPLC – UV (Shimadzu) bằng dung môi methanol. Các thông số cài đặt HPLC – UV được thực hiện theo Parisa rahimi (2016). Hệ thống được điều khiển và thu nhận peak phân đoạn với phần mềm Labsolution V5.71 sp1.
Các peak phân đoạn thu nhận được từ HPLC – UV được phân tích bằng phương pháp HPLC – MS trên hệ thống HPLC – MS Shimadzu. Thực hiện quét phổ của các peak từ khối lượng phân tử/ion từ 600 – 1200 m/z, các peak HPLC – MS thu nhận được phân tích trên phần mềm Labsolution V5.8. Trình tự của các amino acid được thực hiện theo Parisa rahimi (2016) thông qua việc xác định và trích xuất database
42
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
trọng lượng amino acid đặc trưng của peptaibol trong CPD (Comprehensive Peptaibiotics Database). Các trình tự thu được từ phần mềm phân tích peak được cung cấp lên CPD. Sau đó được phân tích và tra cứu trình tự tương đồng.