CHƯƠNG I : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.3 Giới thiệu về peptaibol trong các chủng Trichoderma
1.3.1 Tình hình nghiên cứu về Trichobrachin
Ruiz et al., (2007) phân lập Trichoderma longibrachiatum từ trai xanh (Mytilus edulis) để sản xuất peptaibol ngắn. Các peptaibol gồm 11 amino acid, thu được sau khi phân tách sắc ký, được xác định cấu trúc bằng quang phổ khối phổ (ESI-IT-MS (n), CID-MS (n) và GC/EI-MS). Ba mươi chuỗi đã được xác định, đó là số lượng lớn nhất các chuỗi tương tự cho đến nay được quan sát. Hai mươi mốt chuỗi mới được xác định và chín chuỗi khác tương ứng với peptaibol đã được mô tả. Những peptaibol thuộc cùng một họ peptidic dựng trên mơ hình Ac-Aib-xxx-xxx-xxx-Aib-Pro-xxx-xxx-Aib-Pro-xxol. Chúng được gọi là trichobrachin A khi ở vị trí 2 là Asn và trichobrachin C khi nó là Gln. Các peptaibol được phân tích bằng các phương pháp sắc ký, được khảo sát các hoạt tính gây độc tế bào của chúng. Trichobrachin A-IX và Trichobrachin C thể hiện đặc tính cao nhất gây độc tế bào trên các tế bào nấm gây bệnh trên thực vật.
Bruckner et al., (1993) đã tách và tinh sạch hai peptide kháng khuẩn từ Trichoderma longibrachiatum Rifai và Trichoderma viride., sau đó đặt tên tương ứng là trichobrachin và
trichovirin. Bên cạnh đó thì trình tự amino acid của các peptide kháng khuẩn này cũng đã được xác định theo phương pháp sắc kí HPLC.
Sun et al., (2002) khẳng định rằng việc lên men rắn chủng Trichoderma SMF2 tạo ra
một hợp chất kháng sinh. Hợp chất kháng sinh này cho thấy tác dụng ức chế mạnh trên chủng Pseudomonas solanacearum. Tuy nhiên, các tác giả đã khơng xác định cấu trúc hóa học của kháng sinh này.
Kandasamy et al., (2017) báo cáo rằng Trichoderma đặc hiệu cho vi khuẩn gây bệnh đã được ứng dụng thực tế thành công. Trichobrachin từ Trichoderma sp. là tác nhân chính cho hiệu quả này. Do đó, nhóm tác giả đã sàng lọc tổng cộng 100 chủng Trichoderma chọn chủng
Trichoderma harzianum đối kháng với Fusarium graminearum. Sử dụng chủng (CCTCC-
RW0024) cho các thí nghiệm nhà kính và nghiên cứu ảnh hưởng của nó đối với sự phát triển của bắp ngơ và kiểm sốt sinh học bệnh thối rễ. Các chủng CCTCC-RW0024 có hoạt tính đối
22
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
kháng cao (96,30%), giảm bệnh (86,66%). Các chủng vi khuẩn bám rễ đã được khẳng định bằng việc phân tích eGFP và phân tích qRT-PCR. Kết quả cho thấy Trichoderma làm tăng sự phát triển của vi khuẩn Acidobacteria (18,4%), giảm 66% nấm Fusarium graminearum, và cũng làm tăng sự phát triển của cây.
Chong-Wei Li et al., (2015) đã nghiên cứu trên chủng Trichoderma T-33 và chứng minh rằng hợp chất kháng nấm được tách chiết từ chủng này có hoạt tính ức chế các lồi nấm Cytospora chrysosperma.
Hình 1.7. Tác động ức chế theo độ pha loãng khác nhau của M2 đối với C.
chrysosperma YL sau 5 ngày nuôi cấy. Tỷ lệ pha lỗng (2, 4, 6, 8, 16) hình
(A). (B).
Qiong Wu et al., (2017) đã tìm ra và xác định được một dịng của Trichoderma asperellum., tên là GDFS1009. Các sợi nấm của T. asperellum GDFS1009 có tỷ lệ tăng trưởng cao, khả năng sinh bào tử cao và các hiệu ứng ức chế mạnh mẽ chống lại các mầm bệnh gây ra héo dưa chuột và thối rễ ngô do nấm Fusarium. T. asperellum GDFS1009 tiết ra chitinase, glucanase và protease có thể làm suy giảm thành tế bào của nấm và góp phần vào suy giảm trao đổi chất của tế bào. Các enzyme xylanase là chất tốt để làm tăng sức đề kháng thực vật và tăng cường khả năng miễn dịch của thực vật chống lại các mầm bệnh. RNA sequencing (RNA-seq) và sắc ký khí khối phổ (GC-MS) cho thấy T. asperellum GDFS1009 tạo ra các chất chuyển hóa ban đầu là tiền thân của các hợp chất chống vi trùng, nó cũng tạo ra một loạt các chất chuyển hóa thứ cấp sinh kháng sinh, bao gồm polyketides và alkanes. Thêm vào đó, nghiên cứu này dự đốn sự có mặt của sáu chất kháng khuẩn peptide thông qua sắc ký lỏng phổ hồng ngoại
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
(UPLC-QTOF-MS/MS). Nhóm tác giả đề xuất các hướng nghiên cứu trong tương lai nên tập trung vào các chất chuyển hóa kháng sinh để tạo điều kiện áp dụng rộng rãi trong lĩnh vực kiểm sốt sinh học nơng nghiệp.
Parisa và et al., (2016) đã tiến hành nghiên cứu 5 chủng Trichoderma phân lập từ các loài
T. viride, T. viridescens, T. asperellum, T. longibrachiatum và T. citrinoviride nhằm đánh giá khả
năng sinh peptaibol của chúng. Tất cả các chủng được kiểm tra cho thấy hoạt tính kháng khuẩn đáng chú ý trong quá trình sàng lọc. HPLC-ESI-IT MS được sử dụng để xác định trình tự acid amin của peptaibol. Các hợp chất peptaibol đã phát hiện có chứa 18 hoặc 20 amino acid thuộc nhóm trichobrachin và trichotoxin peptaibol, tương ứng. T. longibrachiatum và T. citrinoviride sản xuất trichobrachin, trong khi trichotoxins được phát hiện trong T. viride, T. viridescens và T. asperellum. Trong số 37 trình tự được xác định, 26 trình tự là các hợp chất mới, chưa được mô
tả, các trình tự cịn lại là trichotoxins (trichotoxin A-50 và T5D2) và trichobrachin (longibrachins AI, AII, AIII, BII và BIII). Các hợp chất trong hai nhóm peptaibol được phát hiện khác nhau chỉ bằng một hoặc một vài thay đổi acid amin.
Raimo Mikkola et al., (2012) đã báo cáo rằng 0,5 - 2,6% khối lượng sinh khối sợi nấm của nấm T. longibrachiatum có chứa peptaibol. Các mẫu thí nghiệm được xác định bằng phương pháp LC/MS chứa một peptaibol có 11 amino acid và tám peptaibol có 20 amino acid, AcAib- Asn-Leu / Ile-Leu / Ile-Aib-Pro-Leu / Ile-Leu / Ile-Aib-Pro-Leuol / Ileol (1175 Da) và AcAib- Ala-Aib-Ala-Aib-Ala / Aib-Gln-Aib-Val / Iva-Aib-Gly-Leu / Ile-Aib-Pro-Val / Iva-Aib-Val / Iva / Aib -Gln/Glu-Gln-Pheol (1936-1965Da), (Aib, acid α-aminoisobutyric, Ac, acetyl, Ileol, isoleucinol, Iva, isovaline, Leuol, leucinol, Pheol, phenylalaninol). Những ảnh hưởng độc đối với tế bào phụ thuộc vào các peptaibol, được đặt tên là trilongins. Các trilongin tạo thành áp suất thẩm thấu thông qua kênh ion Na+ / K+. Tỷ lệ thẩm thấu của 11 amino acid thông qua kênh ion Na+ / K+ là (0,95:1) và 20 amino acid là (0,8:1) cao hơn so với alamethicin. Sự kết hợp giữa 11 và 20 amino acid của hợp chất trilongin tạo trạng thái mở của kênh vận chuyển ion trên màng tế bào duy trì lâu hơn so với những kênh vận chuyển được hình thành bởi một trong hai peptaibol. Với sự kết hợp giữa 11 và 20 amino acid trilongin tỷ lệ 1:2 w/w,
24
đạt được nồng độ hiệu quả trung bình (EC50) là 0,6 μg/ml trong vòng 30 phút, và EC50 đã giảm xuống 0,2 μg/mL khi quá trình kéo dài. Ngược lại, với kênh vận chuyển chỉ có 11 amino acid hoặc 20 amino acid trong 30 phút phơi nhiễm, giá trị EC50 lần lượt là 15 và 3 μg/mL và giảm xuống 1,5 và 0,4 μg/mL khi quá trình kéo dài. Đây là báo cáo đầu tiên về peptaibol hình thành kênh ion có độc tính tổng hợp từ các dịng T. longibrachiatum được phân lập từ các mẫu bệnh phẩm. Trong nghiên cứu này sự hiện diện của Aib hay Aibol (kết nối với một aminino acid khác, thường xuất hiện nhiều nhất là Aib-Pro) có trọng lượng phân tử xác định là 85 Da, các peak so sánh giữa mẫu phân tích và alamethicin được thực hiện bằng phương pháp HPLC – UV ở bước sóng 215nm (hình 1.9), trình tự của peptaibol được xác định dựa trên chuẩn đoán qua phổ HPLS – MS và được dự đốn bằng các tính tốn dựa trên các chuỗi có khối lượng giống chính xác trong cơ sở dữ liệu peptaibiotic và các chuỗi tương đồng (hình 1.8).
.
Hình 1.8. Phổ HPLC – MS peptaibol của Trichobrachin thu được từ T. longibrachiatum
25
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Alamethicin
Hình 1.9. Phổ HPLC – UV của peptaibol Trichoderma
Theo Nguyễn Duy Long và cộng sự (2017) đã sàng lọc được ba chủng nấm Trichoderma có khả năng sinh peptaibol là TC8, TC15 và TC25 và đều có khả năng kháng được nấm bệnh
Fusarium sp và nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm trắng trên cây thanh long. Đồng
thời xây dựng được quy trình tách chiết peptaibol từ nấm Trichoderma.
26
Peptaibol thể hiện các hoạt động kháng sinh kháng lại vi khuẩn và nấm, chỉ riêng điều này là đủ lý do để đặt câu hỏi về tính ảnh hưởng đến sức khỏe con người. Trong một bài báo gần đây (Shi et al., 2010) chỉ ra rằng, tác dụng của peptaibol chỉ ảnh hưởng đối với tế bào ung thư. Shi và cộng sự đã thực hiện một nghiên cứu về cơ chế của peptaibol với các dòng tế bào gan của người ung thư và phát hiện ra rằng peptaibol ngăn chặn sự phát triển và làm tiêu màng ty thể của các tế bào ung thư của con người. Peptaibol Trichokontin VI từ Trichoderma pseudokamingii SMF2 gây ra một dịng tín hiệu Ca2+, hoạt động như một tín hiệu cho q trình apoptosis và có thể được khai thác như một tác nhân chống ung thư mới trong tương lai (Shi et al., 2010). Ngược lại với quan sát này, việc sử dụng các loại peptaibol khác nhau (antiamoebin, trichotoxin A, aibellin, ampullosporin và trichofumin) cho động vật gặm nhấm và động vật nhai lại cho thấy độc tính rất thấp. Peptaibol có trọng lượng phân tử cao nên rất khó đi qua các tế bào thành ruột, gần như hoàn toàn chống lại sự phân hủy của các enzyme (protease, chitinase, glucanase) dưới mọi hình thức và do đó được thải ra từ ruột một cách tự nhiên.
Degenkolb et al., 2008 đã báo cáo rằng trichobrachin và alamethicin đã được báo cáo là gây tan máu hồng cầu nhưng nó địi hỏi tiếp xúc trực tiếp với màng tế bào. Điều này cho thấy rằng peptaibol chỉ có hại khi được tiêm vào hệ thống máu chứ không phải khi áp dụng cho da vì nó sẽ khơng hoạt động, tác dụng độc hại tiềm tàng của peptaibol dường như là nhiều lý thuyết hơn thực tế, có lẽ khơng nhiều hơn các chất tẩy rửa lưỡng tính thơng thường và tốt dưới ngưỡng hậu quả của con người. Sự kết hợp đồng thời của nhiều peptaibol sẽ tăng cường khả năng ứng dụng bảo quản rau, củ, quả trong nhà lưới, nhà kính hoặc trên đồng ruộng một cách đáng kể.
1.4 Giới thiệu về chủng nấm gây bệnh đốm trắng trên thanh long
1.4.1 Giới thiệu về bệnh đốm trắng
Bệnh đốm trắng (đốm nâu) là một loại bệnh nguy hiểm trên thanh long, bệnh hại trên cành và quả gây thiệt hại kinh tế lớn cho nhiều vùng trồng thanh long của bà con.
27
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Dựa vào triệu chứng gây hại mà bà con địa phương thường có những tên gọi khác nhau như bệnh nấm tắc kè, bệnh đốm nâu, bệnh đốm trắng (do trong quá trình phát sinh, phát triển biểu hiện của bệnh thường thay đổi liên tục theo từng giai đoạn diễn tiến của bệnh). Bệnh đốm trắng thanh long do nấm Neoscytalidium dimidiatum gây ra. Loại nấm này có bào tử sinh trưởng khỏe, khả năng lây lan nhanh, chống chịu tốt với nhiều loại thuốc hóa học đặc trị nấm nói chung (có tính kháng thuốc mạnh) do đó hiện nay chưa có một loại thuốc hóa học nào có khả năng đặc trị loại bệnh này (bệnh đốm trắng, đốm nâu). Bào tử nấm gây bệnh bằng cách nảy mầm trên bề mặt thân cành, quả thanh long, sau đó xâm nhập vào trong mơ gây hoại tử.
Bệnh đốm trắng hiện nay được xem là vấn nạn của bà con tại các vùng trồng thanh long. Bệnh phát triển mạnh và lây lan rộng tại các tỉnh trồng thanh long (Bình Thuận – Long An - Tiền Giang – Vĩnh Long...). Hiện nay các nhóm thuốc hóa học gần như khơng có tác dụng triệt đề, nhiều bà con chia sẻ rằng khi phun các loại thuốc được xem là đặc trị bệnh nhưng chỉ có tác dụng “cầm bệnh” một thời gian sau đó chúng lại phát triển mạnh trở lại (tái nhiễm bệnh) (Viện bảo vệ thực vật, 2014).
Triệu chứng bệnh biểu hiện trên cành: Khi bệnh mới phát sinh vết bệnh
thường là những chấm nhỏ (đốm nhỏ) hình trịn màu trắng. Lúc đầu vết bệnh có biểu hiện hơi lõm xuống so với bề mặt xung quanh, gặp điều kiện thuận lợi (ẩm cao) vết bệnh phát triển to dần và có xu hướng phát triển lồi lên (giống như mụn ghẻ nhơ lên) có màu vàng gỉ sắt đến nâu. Khi bệnh nặng số lượng vết bệnh tăng lên và chúng liên kết với nhau tạo thành những vết loang sần sùi nhơ lên có màu nâu giống như da con tắc kè nên bà con nhiều nơi gọi là nấm tắc kè. Trong thời kỳ phát triển bệnh nếu gặp mưa ẩm vết bệnh có thể bị thối nhũn (Viện bảo vệ thực vật, 2014).
28
Hình 1.10. Triệu chứng bệnh khi xuất hiện trên thân, cành thanh long
(Nguồn: Viện bảo vệ thực vật, 2014)
Triệu chứng bệnh biểu hiện trên quả: Tương tự như trên cành, các vết bệnh
nằm rải rác trên bề mặt quả, vết bệnh là những đốm tròn lồi trên bề mặt quả ảnh hưởng đến chất lượng quả.
Hình 1.11. Triệu chứng bệnh trên quả thanh long chín (Nguồn: Viện bảo
vệ thực vật ,2014)
29
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
1.4.2 Tác hại của bệnh đốm trắng
Bệnh đốm trắng trên thanh long diễn biến rất phức tạp, lây lan nhanh trên diện rộng, phát triển mạnh vào mùa mưa. Ở một số vườn thanh long mới trồng, bệnh đốm trắng đã xuất hiện trên cành với tỷ lệ bệnh dao động từ 1 – 5%. Trên một số vườn thanh long kinh doanh, bệnh nặng hơn với tỷ lệ bệnh dao động từ 10 – 50%. Bệnh phát triển mạnh trên cành non và trên quả gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất và chất lượng sản phẩm. Nếu không bị bệnh, trọng lượng quả đạt ≥600g/quả. Nếu như quả bị bệnh, hoặc trọng lượng quả <500 g/quả, dẫn đến thua lỗ. Việc thâm canh quá mức, bón phân và sử dụng thuốc BVTV khơng đúng cách có thể sẽ gây ảnh hưởng đến tình hình dịch hại và ngày càng khó kiểm sốt (Viện bảo vệ thực vật, 2014).
1.4.3 Giới thiệu về chủng nấm gây bệnh Neoscytalidium dimidiatum
Dựa vào đặc điểm hình thái bào tử, cành bào tử, kích thước bào tử và hình thái tản nấm dựa vào khóa phân loại của Ellis (1976) đã xác định tác nhân gây bệnh đốm trắng trên Thanh long là do nấm Scytalidium dimidiatum (B. Sutton & Dyko, 1989), hiện nay nấm còn được gọi tên là Neoscytalidium dimidiatum (Crous & Slippers, 2006).
Neoscytalidium dimidiatum thuộc ngành nấm túi (Ascomycota), Ascomyta có thể
sinh dưỡng dạng sợi đa bào, phân nhánh phức tạp có vách ngăn một tế bào thường có một nhân đơi khi có nhiều nhân, dạng chuyển hóa dạng sợi bắt đầu đứt đoạn ra tạo thành cơ thể đơn bào hình trịn, bầu dục, chứa nhiều nhân hay một nhân. Vách tế bào được cấu tạo bằng chitin hay glucan đa số hoại sinh gây mục gỗ, hoại sinh trên đất, trong nước trên cạn, thực vật, động vật, một số loại ký sinh gây bệnh trên thực vật, động vật đơn bội chiếm ưu thế và người gây ra những thiệt hại lớn.
Ascomyta sinh sản sinh dưỡng bằng sự chia đôi tế bào nảy chồi, đứt đoạn sợi nấm, bào tử áo, bào tử màng dày, sinh sản vơ tính bằng bào tử đỉnh (conidia) và sinh sản hữu tính bằng bào tử túi. Các bào tử khác tính (+; -) sợi nấm đơn bội, phân nhánh thành hệ sợi nấm hình thành các cặp cơ quan sinh sản, giao phối sinh chất, hình thành sợi sinh túi
30
đa bào sau đó phân chia nguyên nhiễm kết hợp thành nhân lưỡng bội rồi giảm nhiễm tạo thành bào tử túi.
Chu trình sống của Ascomyta gồm 3 giai đoạn: giai đoạn đơn bội, giai đoạn song hạch, giai đoạn lưỡng bội, trong đó giai đoạn đơn bội chiếm ưu thế. Một số Ascomyta hình thành quả thể trong đó có quả thể kín, quả thể mở lổ và quả thể hở.
1.4.3.1 Phân loại
Đặc điểm phân loại của nấm N. dimidiatum (Rous & Slippers., 2006) Kingdom: Division: Class: Order: Family: Genus: Species: 1.4.3.2 Đặc điểm hình thái
Tản nấm mọc rất nhanh trên mơi trường PDA, 3 ngày sau khi cấy đã mọc đầy đĩa. Tản nấm ban đầu có màu xám trắng sau 10 ngày ni cấy có màu xám đen đến màu đen, mặt sau tản nấm có màu đen, khơng có vịng đồng tâm. Sợi nấm có màu nâu đen đến màu nâu đậm, vươn cao như bơng gịn trên bề mặt mơi trường. Cành bào tử sinh ra trực tiếp từ bề mặt của môi trường nuôi cấy, cành bào tử đơn lẻ, thẳng hoặc hơi cong. Bào tử đốt có màu nâu nhạt đến nâu sậm, hầu hết khơng có vết ngăn, bào tử hình thành rất nhanh chỉ sau