1. Nghiền mẫu với 500 ml dung dịch CTAB nóng (60oC) bằng chày cối sứ cho tới khi tạo thành dung dịch ựồng nhất có màu xanh ựen (Tế bào bị phá vỡ) dung dịch ựồng nhất có màu xanh ựen (Tế bào bị phá vỡ)
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 99
3. Ủ trong water bath ở 60oC trong 15 phút. Chú ý: trong quá trình ủ ựảo nhẹ vài lần4. Ly tâm với tốc ựộ 12.000 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt ựộ phòng 4. Ly tâm với tốc ựộ 12.000 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt ựộ phòng
5. Hút dịch chiết ở pha trên (700 ộl) sang ống eppendorf mới.
Thêm vào ựó dung dịch Chloroform : isoamylalcohol = 24 : 1. Lắc ựều rồi ựể trên ựá lạnh trong 10 phút.
6. Ly tâm với vận tốc 12.000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt ựộ phòng
7. Lặp lại bước 5 (Hút khoảng 500 ộl)
8. Hút dịch chiết ở pha trên sang eppendorf mới (khoảng 30 ộl)Tủa DNA bằng isopropanol với tỷ lệ 1 : 1 Tủa DNA bằng isopropanol với tỷ lệ 1 : 1
Tủa RNA bằng Li với tỷ lệ Li = 1/4 V (280 ộl dịch = 70 ộl Li) để lạnh trên ựá 30 phút
9. Ly tâm thu DNA (RNA) ở 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở RT 10. Rửa tủa 3 lần bằng ethanol 70%. để khô tự nhiên trong không khắ 10. Rửa tủa 3 lần bằng ethanol 70%. để khô tự nhiên trong không khắ Hoà tan tủa DNA bằng 50 ộl TE
Giữ trong tủ lạnh sâu - 20oC ựể sử dụng lâu dài
Phụ lục III: Thành phần dung dịch nhuộm X - gluc
1. 400 mg X - gluc (giữ ỏ 4oC) hòa tan trong 1ml DMSO hoặc DMF (2-3ml) và lắc, giữ ở 4oC. Dung dịch này bổ sung sau cùng, lấy ra từ tủ lạnh 4oC Dung dịch này bổ sung sau cùng, lấy ra từ tủ lạnh 4oC
2. 3200 ộl (3,2 ml Ờ 25 mg/ml) Chloramphenicol Cân 100 mg trong 4 ml cồn tuyệt ựối lắc ựều. Cân 100 mg trong 4 ml cồn tuyệt ựối lắc ựều. 3. 80 ml NaPO4 PH 7 buffer