3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.2 Phương pháp nghiên cứu.
3.2.2.1 Thắ nghiệm tái sinh a. Cách bố trắ thắ nghiệm
Thắ nghiệm ựược thiết kế hoàn toàn ngẫu nhiên (RCD), mỗi công thức ựược bố trắ nhắc lại 3 lần, mỗi lần 30 Ờ 200 mẫu tùy từng thắ nghiệm.
b. Sử dụng phương pháp nuôi cấy mô hiện hành
Môi trường nuôi cấy mô: MS (Murashige và Skoog 1962), pH = 5,8 trước khi khử trùng có bổ sung ựường sucrose, glucose, manitol, sử dụng các chất ựiều tiết sinh trưởng ở các nồng ựộ khác nhau tùy từng thắ nghiệm. Nguồn vật liệu sử dụng cho thắ nghiệm gồm ựoạn thân không mang mắt ngủ ựược sử dụng từ cây nuôi cấy sau 3 tuần tuổi có 8 lá, cao 7 cm. Sau ựó cắt lấy ựoạn thân dài từ 0,5 Ờ 0,7 cm và mảnh lá ựã cắt bỏ cuống và ựược rạch 2 ựường ở giữa là cấy vào các bình môi trường, mỗi bình cấy 6 mẫu (5 mẫu xung quanh, 1 mẫu ở giữa).
điều kiện khử trùng: hấp ở nhiệt ựộ 121oC, 1,4 atm trong 20 phút.
c. điều kiện nuôi cấy
- Chế ựộ chiếu sáng: 16 giờ sáng / 8 giờ tối. - Cường ựộ chiếu sáng 2500 lux.
- Nhiệt ựộ nuôi cấy 22 ổ 2oC
3.2.2.2 Thắ nghiệm chuyển gen
a) Cách bố trắ thắ nghiệm
Thắ nghiệm ựược thiết kế hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi công thức ựược bố trắ gặp lại 3 lần, 500 mẫu/ công thức.
b) Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn:
Nguồn vi khuẩn: Vi khuẩn ựược lưu giữ trong tủ lạnh -200C trong glycerin.
Môi trường nuôi cấy vi khuẩn: Môi trường LB lỏng, nuôi 17- 19h, ở 280C lắc lỏng 200 vòng/ phút.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 33
10.000 vòng/ phút trong 5 phút và ựược pha trong môi trường pha loãng vi khuẩn c) Các bước chuyển gen cho khoai tây nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
Bước 1: Chuẩn bị lây nhiễm.
-Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường LB lỏng (28oC, 17- 19h, ựược lắc trên máy lắc 200 vòng trên phút).
-Ly tâm tách sinh khối vi khuẩn.
-Dung dịch vi khuẩn ựược pha loãng với tỷ lệ 1/200 trước khi lây nhiễm. -đoạn thân không mang mắt ngủ (0,3 Ờ 0,5cm), lá ựược cắt với kắch thước (0,5 x 0,5cm)
Bước 2: Lây nhiễm và ựồng nuôi cấy mẫu với vi khuẩn Bước 3: Diệt khuẩn bằng kháng sinh cefotaxime 500mg/l
Bước 4: Kiểm tra sự biểu hiện tạm thời của gen chỉ thị GUS bằng dung dịch X- gluc, phương pháp của Jefferson (1987): Ngâm mẫu với dung dịch X- gluc khoảng 15h, 370C trong bóng tối, mẫu chuyển gen có màu xanh chàm ựặc trưng, còn mẫu ựối chứng sẽ không chuyển màu.
Bước 5: Chọn lọc cây chuyển gen
-Chồi tái sinh sau diệt khuẩn ựược cấy vào môi trường chọn lọc có bổ sung 1,0 ppm PPT.
-Mẫu ựược cấy ựịnh kỳ 2 hoặc 3 tuần một lần sang môi trường mới. Lặp lại thao tác cấy chuyển trên môi trường chọn lọc 2 tháng. Các mẫu có mang gen Bar sẽ sống và tái sinh trên môi trường chọn lọc.
Bước 6: Xác ựịnh sự có mặt của gen chuyển bằng phương pháp PCR.
d) Phương pháp PCR kiểm tra sự có mặt của gen chuyển cho các dòng sau chuyển gen với cặp mồi Promoter 35S.
Mồi xuôi: CACTACAAATGCCATCATTGCGATA Mồi ngược: CTTATATAGAGGAAGGGTCTTGCGA - Phương pháp ựánh giá sự có mặt của gen chuyển.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 34
Sử dụng phương pháp PCR. Chu trình chạy PCR:
+ Chu kỳ ựầu: Bước 1: 95oC trong 5 phút, bước 2: 58-60oC trong 1 phút 30 giây, bước 3: 72oC trong 1 phút.
+ Chu kỳ 2:Bước 1: 95oC trong 40 giây, bước 2 và bước 3 tương tự như chu kỳ ựầu. Chu kỳ 2 lặp lại 35 lần.
+ Chu kỳ cuối: Bước 1 và bước 2 tương tự chu kỳ 2, bước 3: 72oC trong 5 phút. Sau ựó sản phẩm PCR ựược giữ ổn ựịnh ở 4oC trước khi ựiện di.
+ Chạy ựiện di: Nồng ựộ agarose 1%, hiệu ựiện thế 150vol, trong 15 phút.
3.2.2.3 Các chỉ tiêu theo dõi: