3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.1Nội dung nghiên cứu
Phần 1: Xây dựng hệ thống tái sinh của cây khoai tây Atlantic
Thắ nghiệm 1: Ảnh hưởng của nền môi trường (manitol, glucose và sucrose) ựến khả năng phát sinh hình thái của mô nuôi cấy
CT 1: MS + 30 g sucrose/l ( MS1)
CT 2: MS + 20 g sucrose/l + 10 g glucose/l (MS2)
CT 3: MS + 15 g sucrose/l + 10 g glucose/l + 5 g manitol/l (MS3)
Từ kết quả của thắ nghiệm 1 chọn ra công thức tốt nhất làm nền cho các thắ nghiệm tiếp theo (Kắ hiệu: MS*)
Thắ nghiệm 2: Ảnh hưởng của chất ựiều tiết sinh trưởng kinetin thuộc nhóm cytokinin ựến khả năng phát sinh hình thái của mô nuôi cấy
CT 1: MS* đ/C CT 2: MS* + 0,5 mg kinetin/l CT 3: MS* + 1,0 mg kinetin/l CT 4: MS* + 1,5 mg kinetin/l CT 5: MS* + 2,0 mg kinetin/l CT 6: MS* + 2,5 mg kinetin/l CT 7: MS* + 3,0 mg kinetin/l
Thắ nghiệm 3: Ảnh hưởng của chất ựiều tiết sinh trưởng BA thuộc nhóm cytokinin ựến khả năng phát sinh hình thái của mô nuôi cấy.
CT 1: MS* đ/C CT 2: MS* + 0,5 mg BA/l CT 3: MS* + 1,0 mg BA/l CT 4: MS* + 1,5 mg BA/l CT 5: MS* + 2,0 mg BA/l CT 6: MS* + 2,5 mg BA/l CT 7: MS* + 3,0 mg BA/l
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 27
Thắ nghiệm 4 : ảnh hưởng của tổ hợp BA và 2,4 D ựến khả năng phát sinh hình thái của mô nuôi cấy
CT 1: MS* đ/C CT 2: MS* + 0,5 mg BA/l + 0,5 mg 2,4 D/l CT 3: MS* + 1,0 mg BA/l + 0,5 mg 2,4 D/l CT 4: MS* + 1,5 mg BA/l + 0,5 mg 2,4 D/l CT 5: MS* + 2,0 mg BA/l + 0,5 mg 2,4 D/l CT 6: MS* + 2,5 mg BA/l + 0,5 mg 2,4 D/l CT 7: MS* + 3,0 mg BA/l + 0,5 mg 2,4 D/l
Thắ nghiệm 5 : ảnh hưởng của tổ hợp BA và IBA ựến khả năng phát sinh hình thái của mô nuôi cấy
CT 1: MS* đ/C CT 2: MS* + 0,5 mg BA/l + 0,2 mg IBA/l CT 3: MS* + 1,0 mg BA/l + 0,2 mg IBA/l CT 4: MS* + 1,5 mg BA/l + 0,2 mg IBA/l CT 5: MS* + 2,0 mg BA/l + 0,2 mg IBA/l CT 6: MS* + 2,5 mg BA/l + 0,2 mg IBA/l CT 7: MS* + 3,0 mg BA/l + 0,2 mg IBA/l Phần 2: Các thắ nghiệm tiền ựề cho chuyển gen
Thắ nghiệm 6: Nghiên cứu hưởng của kháng sinh cefotaxime ựến khả năng sống của vi khuẩn A. tumefaciens.
Công thức Nồng ựộ kháng sinh (ml/l) Ghi chú đ/c Không bổ sung kháng sinh 1 200 2 300 3 500 4 700 5 1000
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 28
Thắ nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kháng sinh diệt khuẩn cefotaxime ựến khả năng sống và tái sinh của callus khoai tây
-đối với ựoạn thân không mang mắt ngủ:
CT1: Môi trường tái sinh tốt nhất + 0 mg/l cefotaxime (đ/C) CT2: Môi trường tái sinh tốt nhất + 300 mg/l cefotaxime CT3: Môi trường tái sinh tốt nhất + 500 mg/l cefotaxime CT4: Môi trường tái sinh tốt nhất + 750 mg cefotaxime/l CT5: Môi trường tái sinh tốt nhất + 1000 mg cefotaxime/l CT6: Môi trường tái sinh tốt nhất + 1250 mg cefotaxime/l -đối với ựoạn thân mang mắt ngủ:
CT1: MS1 + 0 mg cefotaxime/l (đ/C) CT2: MS1 + 300 mg cefotaxime/l CT3: MS1 + 500 mg cefotaxime/l CT4: MS1 + 750 mg cefotaxime/l CT5: MS1 + 1000 mg cefotaxime/l CT6: MS1 + 1250 mg cefotaxime/l
Thắ nghiệm 8:Nghiên cứu ảnh hưởng của chất chọn lọc PPT ựến tỷ lệ sống của mô nuôi cấy
-đối với ựoạn thân không mang mắt ngủ và không mang mắt ngủ: CT1: Môi trường tái sinh tốt nhất + 0 mg/l PPT (đ/C)
CT2: Môi trường tái sinh tốt nhất + 0,5 mg/l PPT CT3: Môi trường tái sinh tốt nhất + 0,75 mg/l PPT CT4: Môi trường tái sinh tốt nhất + 1,0 mg/l PPT CT5: Môi trường tái sinh tốt nhất + 1,5 mg/l PPT
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 29
Phần 3: Nghiên cứu xác ựịnh một số thông số kỹ thuật ựể chuyển gen
Thắ nghiệm 9: Ảnh hưởng của nguồn mẫu cấy ựến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
Công
thức Nguồn mẫu cấy Ghi chú
đ/c 1 đối chứng (không lây nhiễm vi khuẩn) ựoạn thân, mẫu lá. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
đ/c 2
đối chứng (không lây nhiễm vi khuẩn) ựoạn thân, mẫu lá nuôi cấy trên môi trường MS và môi trường tái sinh tốt nhất.
2 đoạn thân
Vi khuẩn mang gen Gus Lây nhiễm: Ngâm trong dung dịch vi khuẩn 5 phút, ựồng nuôi cấy.
Lượng mẫu: 500 mẫu/ công thức.
3 Mẫu lá
Thắ nghiệm 10: Ảnh hưởng của phương pháp lây nhiễm vi khuẩn ựến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
+ Cách 1: Mẫu cấy ựược cắt trên giấy khô sau ựó ngâm vào dung dịch vi khuẩn trong thời gian 5 phút sau ựó vớt ra, ựể khô trên giấy thấm vô trùng.
+ Cách 2: Mẫu cấy ựược cắt trên giấy khô, cấy trên môi trường ựồng nuôi cấy, sau ựó dùng micropipette hút dịch vi khuẩn trên nhỏ vào mẫu, mỗi mẫu cấy chỉ nhỏ 10 ộl dung dịch vi khuẩn.
+ Cách 3: Mẫu cấy ựược cắt trong môi trường ựồng nuôi cấy, sau ựó chuyển sang lây nhiễm trong dung dịch vi khuẩn 5 phút.
+ Cách 4: Mẫu cấy ựược cắt trong môi trường ựồng nuôi cấy, sau ựó cấy trên môi trường ựồng nuôi cấy, rồi dung micropipette hút dịch vi khuẩn trên nhỏ vào mẫu, mỗi mẫu cấy chỉ nhỏ 10ộl dùng dịch vi khuẩn.
+ Cách 5: Mẫu cấy ựược cắt trong môi trường ựồng nuôi cấy có khuẩn pha loãng.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 30
Công
thức Cách lây nhiễm Ghi chú
đ/c 1 đối chứng (không nhiễm khuẩn)
đ/c 2
đối chứng (không nhiễm khuẩn), nuôi cấy trên môi trường MS và môi
trường tái sinh tốt nhất
2 Cách 1
3 Cách 2
4 Cách 3
5 Cách 4
Nguồn mẫu: Loại mẫu tốt nhất từ thắ nghiệm 1.
Lượng mẫu: 500 mẫu/công thức.
6 Cách 5
Thắ nghiệm 11: Ảnh hưởng của thời gian tiền nuôi cấy ựến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
Công
thức Thời gian tiền nuôi cấy (ngày) Ghi chú đ/c 1 đối chứng không nhiễm khuẩn.
đ/c 2 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
đối chứng không nhiễm khuẩn, nuôi cấy trên môi trường MS và
môi trường tái sinh tốt nhất
2 0
3 1
4 3
5 5
Nguồn mẫu: Loại mẫu tốt nhất từ thắ nghiệm 1.
Lây nhiễm: ngâm trong dung dịch vi khuẩn 5 phút, ựồng nuôi cấy. Lượng mẫu: 500 mẫu/ công thức.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 31
Thắ nghiệm 12: Ảnh hưởng của thời gian ựồng nuôi cấy ựến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
Công thức Thời gian ựồng nuôi cấy
(ngày) Ghi chú
đ/c 1 đối chứng không nhiễm khuẩn.
đ/c 2
đối chứng không nhiễm khuẩn, ựược cấy trên môi
trường MS, và môi trường tái sinh tốt nhất
2 1
3 3
4 5
Nguồn mẫu: Loại mẫu tốt nhất từ thắ nghiệm 1.
Cách lây nhiễm: tốt nhất từ thắ nghiệm 2.
Thời gian tiền nuôi cấy tốt nhất từ thắ nghiệm 3.
Lượng mẫu: 500 mẫu/ công thức.
5 7
Thắ nghiệm 13: đánh giá tổng hợp của các công thức tối ưu tới khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
Công
thức Phương pháp Ghi chú
đ/c 1 đối chứng không nhiễm khuẩn.
đ/c 2
đối chứng không nhiễm khuẩn, ựược nuôi cấy trên môi trường MS (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
và môi trường tái sinh tốt nhất
Nguồn mẫu. Vi khuẩn Lượng mẫu: 500mẫu/ công thức
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 32