Hầu hết các nghiên cứu tái sinh cây khoai tây trên thế giới ựều chủ yếu phục vụ mục ựắch là chuyển gen và dung hợp tế bào trần. đã có rất nhiều nghiên cứu về tái sinh khoai tây trên thế giới.
Sang Ho Chung and Woong Seop Sim (1987) ựã nghiên cứu tái sinh và chuyển gen vào 2 giống khoai tây Dejima và Superior nhờ vi khuẩn A. tumefaciens
KU-12 và Ti plasmid DNA(pTi-12) vào mô thân cây khoai tây. Kết quả cho thấy, mô thân chuyển gen ựược cảm ứng và tái sinh trên môi trường không có chất ựiều tiết sinh trưởng do sự có mặt của lysopine dehydrogenase (LpDH) hoạt ựộng và biểu hiện ở trong mô thân. Phân tắch ựoạn T-DNA ựược chuyển vào genome của cây khoai tây ựã xác ựịnh ựược ựoạn gen Sma I của Ti plasmid (pTi-12) có các kắch thước 9,7 kp và 4,55 kb nằm trong trình tự kết thúc của vùng T Ờ DNA.
Năm 2002, R. H. Sarker và Barkat Murtaja Mustafa ựã nghiên cứu tái sinh và chuyển gen vào 2 giống khoai tây bản ựịa của Bangladesh ựã cho thấy sự tái sinh chồi tốt nhất của 2 loài khoai tây bản ựịa Lal Pakri và Jam Alu của Banglades ựược quan sát trên môi trường MS có bổ sung 1mg/L BAP và 0,1 mg/L GA3. Nó ựược biểu hiện thông qua số lượng chồi/mẫu cấy và số lượng ựốt/chồi và chiều cao của chồi. Môi trường MS có chứa 0,1 mg/L IAA cho phát sinh hình thái tạo rễ lớn nhất
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 19
từ các chồi ựược cắt. 2 chủng vi khuẩn ựược sử dụng cho chuyển gen ở ựây là LBA4404 có chứa plasmid pBI121 và EHA105 chứa plasmid pCAMBIA1301. Cả 2 plasmid này ựều chứa gen chỉ thị gus. Trong ựó, plasmid pBI121 có chứa gen chọn lọc nptII kháng kanamycin và plasmid pCAMBIA1301 chứa gen chỉ thị chọn lọc kháng hygromycin, hptII. Kết quả chuyển gen bằng phương pháp nhuộm x - gluc cho thấy gen GUS ựược chuyển vào trong mô lá của chồi tái sinh.
Năm 2005, Iqbal Husain ựã nghiên cứu sự tái sinh của 3 dòng khoai tây là Cardinal, Altamash and Diamont. Kết quả cho thấy môi trường tái sinh thắch hợp là: MS có bổ sung tổ hợp 2,0 mg/L BAP và 0,5 mg/L IAA. Cả 3 giống ựều có mẫu tái sinh thắch hợp nhất là ựoạn mắt của khoai tây. Trong ựó, giống khoai tây Cardinal cho sự tái sinh trực tiếp chồi tốt nhất.
Shirley và cs., (2001) ựã báo cáo sự ảnh hưởng lớn của sự tái sinh in vitro từ cuống lá của lá non trên nền môi trường MS có bổ sung 3,0 mg/L BAP, GA3, bạc thiosulphate, thidiazuron và IAA ở nồng ựộ 1 mg/L. So sánh với những hệ thống tái sinh khác, những kết quả ở ựây cho tỷ lệ tái sinh trực tiếp cao ở protocol bậc 1 (Keil và cs., 1989; Tavazza và cs., 1998) và có thể lớn hoặc cao hơn protocols bậc 2 và 3 (Webb và cs., 1983; De Block, 1988; Visser và cs., 1989; Hulme và cs., 1992, Hansen và cs., 1999). Philip & Hampson (1995) cũng ựã sử dụng loại mẫu là mô lá và lóng thân và cho tỷ lệ tái sinh cao ở 12 dòng.
Như vậy nguồn mẫu cho nghiên cứu tái sinh trên cây khoai tây rất ựa dạng. Trong ựó nguồn mẫu là ựoạn thân và mô lá chiếm tỷ lệ cao, chúng ựược nghiên cứu trên nền môi trường MS ựược bổ sung các chất ựiều tiết sinh trưởng IAA (từ 0,2 Ờ 1 mg/L), BAP (từ 1 Ờ 3 mg/L) là chủ yếu và một số có cả zeatin, GA3, bạc thiosulphate, thidiazuron.
Tinh bột ựược thấy ở hầu hết cây trồng như khoai tây, có 20-30% amyloza (mạch thẳng) và 70- 80% amylopectin (mạch nhánh). Tỉ lệ amyloza/amylopectin ảnh hưởng lớn ựến tắnh chất hóa lý của tinh bột. để tạo khoai tây với hàm lượng amyloza cao tương ứng với hàm lượng amylopectin thấp, cây ựược biến nạp bằng
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 20
khiển phiên mã của promoto 35S. Ở các dòng chuyển gen chỉ còn khoảng 1% hàm lượng hoạt tắnh enzyme tạo nhánh tinh bột bình thường, các phân ựoạn amyloza tăng từ khoảng 28% ựến 60-89% hàm lượng tinh bột. [2]
Năm 1995, khoai tây có gen Bt do công ty Monsato ựưa ra ựã trở thành cây chuyển gen Bt ựầu tiên ựược thương mại hóa, với gen thể hiện là cry IIIA, ựể kiểm soát bọ cánh cứng Colorado. Giống khoai tây này ựược phép phát triển tại Canada, Nhật, Mexico và Georgia. [4]
Theo Korean Biochem. J. (1987), nghiên cứu chuyển gen vào tế bào củ khoai tây nhờ Agrobacterium tumefaciens và Ti Plasmici DNA. Kết quả ựược chỉ ra như sau: Những khối u hình thành ở củ khoai tây là kết quả của sự xâm nhiễm với Agrobacterium tumefaciens KU-12. Và từ ựó thu ựược cây tái sinh, ựã nhận ra rằng hoạt ựộng của lysopine dehydrogenase (LpDH) có mặt trong sự hình thành khối u của cây. Trong các cây trồng có khoai tây là cây hai lá mầm, mà trong ựó khối u có thể ựược tạo ra bởi dicotyledonous A.tumefaciens (Anand and Heberlein, 1977; Cha et al,1983). Sự tái sinh khoai tây từ nuôi cấy mô củ là có thể thực hiện ựược (Lam, 1975; Jarret et al,1980; Kikuta and Okazawa, 1982; Silva, 1985).Với bài nghiên cứu này, chuyển gen vào tế bào củ khoai tây bằng A. tumefaciens KU-12 và Ti plasmid DNA(pTi-12) ựã mang lại những kết quả làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo. [55]
Angharad M. R. Gatehouse, Rachel E. Down, Kevin S. Powell, Nicolas Sauvion, Yvan Rahbé, Christine A. Newell, Andrew Merryweather, William D. O. Hamilton and John A. Gatehouse , Nghiên cứu chuyển gen cho khoai tây tăng khả năng chống lại loài rệp cây Myzus persicae. Cây chuyển gen với các mức ựộ phát hiện của RNA ựã ựược chọn lọc dưới sự mô tả cụ thể các mức ựộ biểu hiện protein bởi phương pháp phân tắch sử dụng kháng thể chống lại với từng protein tương ứng. [44]
Kaniewski and Lawson (1998) Chuyển ựồng thời vào cây khoai tây chống chịu cả 2 loại virus PVY và PLRV. Có nhiều vắ dụ về cây chuyển gen mang những trình tự ựặc biệt có thể chống chịu lại sự gây bệnh của virus ựã ựược công bố. Sử
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 21
dụng chuyển gen qua Agrobacterium tumefaciens. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với kết quả nghiên cứu của Kaniewski and Lawson (1998). Sử dụng cấu trúc pZPKan-LMV-REP Plasmid mang gen quy ựịnh tạo vỏ protein LMV (cp-LMV) dưới sự kiểm soát của promoter 35S CaMV. [49]
Vazquez Rovere C, Asurmendi S, Hopp HE.(2001) Nghiên cứu chuyển gen khoai tây chống chịu virus gây bệnh xoăn lá khoai tây (PLRV) với trình tự các gen tổng hợp từ khuôn mẫu RNA và sự liên quan tới kỹ thuật sao chép làm câm gen.. để làm sáng tỏ cơ chế bảo vệ sự xâm nhiễm của PLRV, 3 bản của ORF2b ựã ựược xây dựng dưới sự ựiều khiển của 35S CaMV và ựược ựưa vào cây khoai tây (cv. Kennebec) bằng phương pháp chuyển gen gián tiếp qua Agrobacterium tumefaciens. Các thắ nghiệm lây nhiễm chỉ ra rằng các cây chuyển gen kháng có thể thu ựược một vài dạng, nó gợi ý rằng cơ chế bảo vệ là ựộc lập của sự biểu hiện của protein và các RNA trung gian. Các thắ nghiệm bắn gen vào mô lá thu ựược cây chuyển gen sử dụng gen mã hóa với protein GUS-ORF2b, và sau ựó là các ựiểm biểu hiện rõ ràng của GUS, từ ựó thấy rằng sự bảo vệ là gián tiếp bởi cơ chế sau chép làm câm gen. [58]
A. Romado, K.Raemakers, R. visser, H. Mooibrock. (2001), Chuyển gen vào khoai tây bằng phương pháp bắn gen. Vật liệu ựược sử dụng là ựoạn thân, lá và lát mỏng củ. Sự ổn ựịnh của cây chuyển gen phụ thuộc vào các thông số sinh học như dạng mô, giai ựoạn phát triển trước khi chuyển gen... và các thông số vật lý như áp suất, khoảng cách bắn gen, kết quả chỉ ra rằng vật liệu thắch hợp nhất cho bắn gen là sử dụng ựoạn thân, kết quả này tạo cơ sở cho việc chuyển gen nhiều loại cây trồng có giá trị khác. [45]
P.J. Barrell, Shang Yongjin, P.A. Cooper and A.J. Conner (2002), nghiên cứu hệ thống chọn lọc với cây khoai tây chuyển gen sử dụng vector T-DNA. đây là phương pháp rất có ý nghĩa và thu ựược nhiều thành công, với chuyển quy tụ gen vào các giống thắch hợp. Kết quả thu ựược các dòng khoai tây chuyển gen với mỗi gen chỉ thị có thể ựược tổng kết như sau: Kháng kanamycin > kháng hygromycin > kháng phosphinothricin > kháng phleomycin > kháng methotrexate. [53]
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 22
Mahmoud M. Saker (2003), cùng các nhóm nghiên cứu ựã nghiên cứu khoai tây chuyển gen với gen quy ựịnh tạo vỏ protein với virus Y khoai tây. Hầu hết các kỹ thuật chuyển gen qua Agrobacterium tumefaciens với gen kháng sâu ựã ựược sử dụng. Trong bài nghiên cứu này, chuyển gen vào cây khoai tây chứa gen quy ựịnh hình thành vỏ protein virus Y khoai tây (cp-LMV). Và ựã ựạt ựược một số kết quả, như tìm ựược các ựiều kiện cho chuyển gen vào các mô khoai tây khác nhau, sử dụng
Agrobacterium tumefaciens mang EHA 105 chứa gen neomycin phosphotransferase II (nptII),mà làm cho cây kháng thuốc kháng sinh tối ưu. [50] [43]
Susannah G. Cooper, David S. Douches & Edward J.Grafius nghiên cứu kết hợp kỹ thuật di truyền và phương pháp tạo giống truyền thống ựể nâng cao khả năng kháng bọ cánh cứng (Colorado beetle) ở cây khoai tây. Bọ cánh cứng khoai tây có khả năng kháng thuốc trừ sâu có thể liên quan tới khả năng chịu ựược chất glycoalkaloids sản xuất ra từ cây khoai tây và các cây họ cà khác. Gylcoalkaloids là chất ức chế cholinesterase, chức năng giống như thuốc trừ sâu organophosphate và carbamate (Lawson et al, 1993.; Rangarajan et al, 2000.). Hầu hết các glycoalkaloids ựược phân phối khắp củ khoai tây và lá cây. Tuy nhiên, Solanum chacoense Biter, một loài khoai tây hoang dại, sản xuất một leptine glycoalkaloid chỉ thể hiện ở bộ lá (Lorenzen et al, 2001.). Các tác giả ựã tiến hành phân lập và chuyển gen tạo chất này từ khoai tây dại vào khoai tây trồng nhằm mục tiêu tạo giống khoai tây kháng bọ cánh cứng khoai tây Colorado (Adang et al, 1993.; Perlak et al., 1993). [57]
S. R. Sarker, M. Hossain and F. Shirin, nghiên cứu giai ựoạn ựồng lây nhiễm ựể tăng hiệu quả chuyển gen của hai giống khoai tây Cardinal and Atlas. Trung bình tỉ lệ chuyển nạp gen với ựoạn thân tương ứng là 58,4% và lá là 38% ựối với giống Atlas, trong khi ựó với giống Cardinal là 47,6% với ựoạn thân và 27,6% với mẫu lá. Tỷ lệ sống sót cao nhất và hoạt ựộng trong thời gian ngắn của GUS ựã chỉ ra là ở giống Atlas và Cardinal trong 45 phút ủ với Agrobacterium. [56]
Năm 2005, Craig W và cs ựã nghiên cứu chuyển gen nhờ vi khuẩn
A.tumefaciens vào cây khoai tây và so sánh kết quả chuyển gen giữa 2 loại mẫu là mô lá và protoplast trên môi trường PEG. Kết quả cho thấy chuyển gen vào protoplast cho kết quả cao gấp nhiều lần so với mô lá. Ở mô lá tỷ lệ chuyển gen là
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 23
0,5%, trong khi ựó ở protoplast là 67,2%. Kết quả ựược xác ựịnh thông qua biểu hiện của gen GUS.
Yujun Xing, Qing Yang, Qin Ji, Yuming Luo, Yunfeng Zhang, Ke Gu and Dengzhan Wang. Nghiên cứu tối ưu hóa những thông số trong quá trình chuyển gen vào callus phát triển phôi khoai lang bằng Agrobacterium tumefaciens. Sử dụng vector pTCK303 mang gen GUS và sử dụng promoter CaMV 35S. Các thống số tối ưu bao gồm nồng ựộ vi khuẩn, thời gian tiền nuôi cấy, thời gian ựồng nuôi cấy, thời gian rửa khuẩn, nồng ựộ acetosyringone (AS). Và thời gian xử lý mannitol. 4 ngày tiền nuôi cấy, 4 ngày ựồng nuôi cấy, 10 phút rửa khuẩn, 200 ộM acetosyringone và 60 phút xử lý mannitol ựã thu ựược kết quả chuyển gen cao nhất. [60]
Gianfranco Diretto và cs., (2006) ựã nghiên cứu làm câm gen tổng hợp enzyme phân giải quá trình sinh tổng hợp carotenoid từ bước chuyên hóa tạo thành β Ờ epsilon (một nhánh của carotenoid). Cơ chế này ựược thực hiện bằng cách chuyển gen chứa ựoạn ựối bản thông qua cơ chế chuyển gen nhờ A.tumefaciens. Nhờ cơ chế này β-carotenoid (tiền vitamin A) ựược tổng hợp nhiều hơn (tăng gấp 2,5 lần so với ban ựầu).
Effat Badr, Yasser Mabrouk, Farouk Rakha and Abdel-Halim Ghazy, nghiên cứu chuyển gen khoai tây bằng Agrobacterium tumefaciens và phân tắch sự ổn ựịnh di truyền của genome bằng phương pháp RAPD. để tăng hệ thống khoai tây chuyển gen và sự tái sinh, 4 giống khoai tây ựã ựược chuyển gen sử dụng
Agrobacterium tumefaciens mang gen β-glucuronidase (GUS). Kết quả thu ựược chồi cao nhất của giống Spunta cv. Nuôi cấy mô thân cho kết quả tạo callus cao hơn và tái sinh sau chuyển gen chọn ựược cũng cao hơn so với nuôi cấy mô lá và sử dụng mô thân ổn ựịnh hơn về mặt di truyền. [46]