- Mô thân sùi callus to màu xanh nhạt, chắc Tới tuần thứ 4 xuất hiện mầm chồi Sau ựó từ mầm
1: Mẫu DNA của cây không chuyển gen (đ/C )
2: Vi khuẩn A.tumefaciens chủng EHA 105 mang vector ITB2c (đ/C+); 3: ựối chứng trắng (nước cất 2 lần); 4 Ờ 13: mẫu DNA cần kiểm tra sự biểu hiện của gen CryIA(c). (nước cất 2 lần); 4 Ờ 13: mẫu DNA cần kiểm tra sự biểu hiện của gen CryIA(c).
Như vậy: có thể ựưa ra ựược quy trình chuyển gen vào cây khoai tây nhờ vi khuẩn A.tumefaciens như sau:
1000 bp
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 82
Sơ ựồ thể hiện quy trình chuyển gen cho cây khoai tây (Solanum tuberosum L.) nhờ vi khuẩn A.tumefacens
đồng nuôi cấy 3 ngày
MS (không có NH4NO3) + 20mg/l AS + 15g/l saccharose + 30g/l manitol + 5g/l glucose 10mM/l MES + 2ppm/l BA + 1g/l cassamino acid + 700mg/l L-asparagine
monohydrate + 700mg/l L-glutamine + 7g/l agar. pH = 6,0- 6,2
Cấy mẫu vào môi trường diệt khuẩn
MS + 15g/l saccharose + 30g/l manitol + 5g/lgluco +2ppm/l BA + 300mg/l cefotaxime + 7g/l agar, pH = 6,0 Ờ 6,2.
Rửa khuẩn
Vi khuẩn ựược rửa bằng nước cất vô trùng hoặc môi trường MS vô trùng có bổ xung cefotaxime với nồng ựộ 300mg/l. Mẫu ựược rửa 2 Ờ 3 lần, rửa mẫu nhẹ
tránh hỏng mẫu.
Xác ựịnh sự biểu hiện tạm thời của gen GUS( nhuộm X- gluc)
Cấy vào môi trường chọn lọc
MS + 15g/l saccharose + 30g/l manitol + 5g/lgluco +2ppm/l BA + 1ppm/l PPT + 7g/l agar, pH = 6,0 Ờ 6,2.
Xác ựịnh kết quả chuyển gen đoạn thân không mang mắt ngủ
(cắt tạo kắch thước: 3-5mm)
Tiền nuôi cấy 5 ngày
(MS+15g/lsaccharose++30g/lmanitol+ 5g/lgluco + 2ppm/lBA+7g/l agar, pH=6,0- 6,2)
Lây nhiễm với vi khuẩn A. tumerfaciens
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 83
4.4. So sánh và thảo luận kết quả ựề tài với các kết quả nghiên cứu chuyển gen ở cây khoai tây ựã ựược công bố ở Việt Nam. ở cây khoai tây ựã ựược công bố ở Việt Nam.
đinh Trường Sơn, Nguyễn Thị Phương Thảo, Nguyễn Thị Thanh Phương, Nguyễn Thị Thu Thủy, Nguyễn Quang Thạch Viện Sinh học Nông nghiệp, Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội, nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh in vitro cây khoai tây phục vụ chọn tạo giống mới bằng kỹ thuật chuyển gen và dung hợp tế bào trần, ựã xác ựịnh ựược môi trường MS2 ((MS + 15 g sacaroza + 30 g manitol + 5 g glucoza) + 2 mg BA/lắt), ựoạn thân giống Diamant có vị trắ càng gần gốc thì cho tỉ lệ sống và khả năng tái sinh chồi cao ( tỷ lệ sống ựạt 100%, tỷ lệ mẫu tái sinh tạo chồi ựạt 94,4%, số chồi tái sinh/ mẫu cấy ựạt 20,3% chồi). Mẫu cấy là ựoạn thân cho khả năng tái sinh chồi cao nhất, đối với cây khoai tây: Giống Diamant cho tỷ lệ tái sinh ựạt 78,6%, chồi tái sinh trực tiếp dưới dạng cụm chồi.Trong các môi trường nghiên cứu, mô lá của giống Diamant không hề có sự tái sinh tạo chồi. [25]
đinh Trường Sơn, Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh in vitro trên cây khoai tây phục vụ chuyển gen, ựưa ra kết luận có thể sử dụng kháng sinh Cefotaxime ở nồng ựộ ựến 300ppm trong môi trường diệt khuẩn khi tiến hành chuyển gen bằng Agrobacterium tumefaciens. Và sử dụng nồng ựộ PPT ở mức 1,0ppm làm nồng ựộ dùng cho chọn lọc các mô thân khoai tây ựã ựược chuyển gen kháng PPT.(26)
Ở nước ta, Lê Thị Ánh Hồng và cs.(2006), là các tác giả ựầu tiên ở nước ta nghiên cứu chuyển gen vào cây có củ với ựề tài Ộnghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học trong chọn tạo giống kháng sâu bệnh và có chất lượng cao ở một số giống cây có củỢ (KC-04.22). Trên ựối tượng là cây khoai tây tác giả ựã chuyển gen CP của virus LMV ựã thu ựựợc 02 dòng khoai tây có gen kháng virus.
Như vậy ở nước ta, các nghiên cứu về tái sinh và chuyển gen trên cây khoai tây ựều chưa có nhiều. đặc biệt các nghiên cứu về chuyển gen khoai tây còn hết sức hạn chế và chưa có nghiên cứu chắnh thức nào ựược áp dụng trong thực tế. Việc nghiên cứu tái sinh, chỉ mới ựược thực hiện trên giống khoai tây Diamant. Vì vậy, ựề tài: ỘNghiên cứu chuyển gen Cry 1Ac cho cây khoai tây (solanum tuberosum L.)
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 84
bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciensỢ góp phần xây dựng ựược hệ thống tái sinh trên cây Atlantic, từ ựó chuyển gen CryIA(c) vào cây khoai tây Atlantic và Diamant, làm cơ sở cho việc chuyển gen mong muốn khác vào cây khoai tây, làm tiền ựề và thúc ựẩy việc ứng dụng phương pháp chuyển gen trong công tác chọn tạo giống cây trồng ở Việt Nam.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 85