CHƢƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng, địa điểm và vật liệu nghiên cứu
2.1.2. Vật liệu nghiên cứu
Trong nghiên cứu này, chúng tơi phân tích các chỉ thị phân tử thu đƣợc từ 85 (Bảng 1) mẫu bao gồm:
64 mẫu mô cơ đuôi cá sấu Xiêm: 12 mẫu tại vƣờn thú Thủ Lệ (Hà Nội), 28
mẫu từ vƣờn thú Sài Gòn, 1 mẫu tại trạm cứu hộ Hòn Me (Kiên Giang), 2 mẫu tại vƣờn thú Tây Ban Nha và 21 mẫu tại vƣờn thú Lào (Viêng chăn) (trong đó có 4 mẫu nghi ngờ là thuần chủng).
3 mẫu phân cá sấu tại bản Sóc Khammoune, Lào.
4 mẫu mô cơ đuôi cá sấu Xiêm thuần chủng tại vƣờn quốc gia Cát Tiên.
4 mẫu máu cá sấu Xiêm thuần chủng tại các vƣờn thú Châu Âu.
5 mẫu mô cơ đuôi cá sấu Cuba (C. rhombifer) bao gồm: 1 mẫu từ vƣờn thú
Zagreb (Croatia), 1 mẫu từ vƣờn thú Terrariet Vissenbjerg (Đan Mạch), và 3 mẫu từ vƣờn thú Hoyerswerda Zoo (Đức).
5 mẫu máu cá sấu nƣớc mặn (C. porosus) tại vƣờn thú Wilhelma Zoo (Đức).
Các mẫu vật trong các khu vực ni nhốt đƣợc thu bởi nhóm nghiên cứu của Thomas Zigler và Lƣu Quang Vinh từ năm 2016 - 2018. Điều tra thực địa tại VQG Cát Tiên đƣợc tiến hành để thu mẫu thuần chủng làm đối chứng và khảo sát sơ bộ về hiện trạng và các mối đe doạ đến lồi (chi tiết đƣợc trình bày ở phần sau).
Bảng 1. Danh sách các mẫu sử dụng trong nghiên cứu
STT Tên lồi Kí hiệu Kí hiệu ngồi Bản chất mẫu Địa điểm PTN thực địa
1 C. cf. siamensis Cr1 mô đi Kiên Giang: Hịn Me 2 C. cf. siamensis Cr7 Bs1 phân Tỉnh Khammouane, Lào 3 C. cf. siamensis Cr8 Bs2 phân Tỉnh Khammouane, Lào 4 C. cf. siamensis Cr9 Bs3 phân Tỉnh Khammouane, Lào 5 C. cf. siamensis Cr10 Saigon 1 mơ đi Vƣờn thú Sài Gịn 6 C. cf. siamensis Cr11 Saigon 2 mơ đi Vƣờn thú Sài Gịn 7 C. cf. siamensis Cr12 Saigon 3 mô đi Vƣờn thú Sài Gịn 8 C. cf. siamensis Cr13 Saigon 4 mô đuôi Vƣờn thú Sài Gòn 9 C. cf. siamensis Cr14 Saigon 5 mô đuôi Vƣờn thú Sài Gòn 10 C. cf. siamensis Cr15 Saigon 6 mô đuôi Vƣờn thú Sài Gòn 11 C. cf. siamensis Cr16 Saigon 7 mô đuôi Vƣờn thú Sài Gòn 12 C. cf. siamensis Cr17 Saigon 8 mô đi Vƣờn thú Sài Gịn 13 C. cf. siamensis Cr18 Saigon 9 mơ đi Vƣờn thú Sài Gịn 14 C. cf. siamensis Cr19 Saigon 10 mơ đi Vƣờn thú Sài Gịn 15 C. cf. siamensis Cr20 Saigon 11 mơ đi Vƣờn thú Sài Gịn 16 C. cf. siamensis Cr21 Saigon 12 mơ đi Vƣờn thú Sài Gịn 17 C. cf. siamensis Cr22 Saigon 13 mô đi Vƣờn thú Sài Gịn 18 C. cf. siamensis Cr23 Saigon 14 mô đuôi Vƣờn thú Sài Gòn 19 C. cf. siamensis Cr24 Saigon 15 mô đuôi Vƣờn thú Sài Gòn 20 C. cf. siamensis Cr25 Saigon 16 mô đuôi Vƣờn thú Sài Gòn 21 C. cf. siamensis Cr26 Saigon 17 mô đuôi Vƣờn thú Sài Gòn 22 C. cf. siamensis Cr27 Saigon 18 mô đi Vƣờn thú Sài Gịn 23 C. cf. siamensis Cr28 Saigon 19 mơ đi Vƣờn thú Sài Gịn 24 C. cf. siamensis Cr29 Saigon 20 mơ đi Vƣờn thú Sài Gịn 25 C. cf. siamensis Cr30 Saigon 21 mơ đi Vƣờn thú Sài Gịn 26 C. cf. siamensis Cr31 Saigon 22 mơ đi Vƣờn thú Sài Gịn 27 C. cf. siamensis Cr32 Saigon 23 mô đi Vƣờn thú Sài Gịn 28 C. cf. siamensis Cr33 Saigon 24 mô đuôi Vƣờn thú Sài Gòn 29 C. cf. siamensis Cr34 Saigon 25 mô đuôi Vƣờn thú Sài Gòn 30 C. cf. siamensis Cr35 Saigon 26 mô đuôi Vƣờn thú Sài Gòn 31 C. cf. siamensis Cr36 Saigon 27 mô đuôi Vƣờn thú Sài Gòn 32 C. cf. siamensis Cr37 Saigon 28 mô đi Vƣờn thú Sài Gịn 33 C. cf. siamensis Cr38 Hanoi 41 mô đuôi Vƣờn thú Thủ Lệ 34 C. cf. siamensis Cr39 Hanoi 30 mô đuôi Vƣờn thú Thủ Lệ 35 C. cf. siamensis Cr40 Hanoi 31 mô đuôi Vƣờn thú Thủ Lệ 36 C. cf. siamensis Cr41 Hanoi 32 mô đuôi Vƣờn thú Thủ Lệ
37 C. cf. siamensis Cr42 Hanoi 33 mô đuôi Vƣờn thú Thủ Lệ 38 C. cf. siamensis Cr43 Hanoi 34 mô đuôi Vƣờn thú Thủ Lệ 39 C. cf. siamensis Cr44 Hanoi 35 mô đuôi Vƣờn thú Thủ Lệ 40 C. cf. siamensis Cr45 Hanoi 36 mô đuôi Vƣờn thú Thủ Lệ 41 C. cf. siamensis Cr46 Hanoi 37 mô đuôi Vƣờn thú Thủ Lệ 42 C. cf. siamensis Cr47 Hanoi 38 mô đuôi Vƣờn thú Thủ Lệ 43 C. cf. siamensis Cr48 Hanoi 39 mô đuôi Vƣờn thú Thủ Lệ 44 C. cf. siamensis Cr49 Hanoi 40 mô đuôi Vƣờn thú Thủ Lệ
45 C. cf. siamensis Cr52 Lao Zoo 5 mô đuôi Vƣờn thú Lào, Viêng Chăn 46 C. cf. siamensis Cr53 Lao Zoo 14 mô đuôi Vƣờn thú Lào, Viêng Chăn 47 C. cf. siamensis Cr54 Lao Zoo 18 mô đuôi Vƣờn thú Lào, Viêng Chăn 48 C. cf. siamensis Cr55 Lao Zoo 19 mô đuôi Vƣờn thú Lào, Viêng Chăn 49 C. cf. siamensis Cr56 Lao Zoo 15 mô đuôi Vƣờn thú Lào, Viêng Chăn 50 C. cf. siamensis Cr57 Lao Zoo 2 mô đuôi Vƣờn thú Lào, Viêng Chăn 51 C. cf. siamensis Cr58 Lao Zoo 4 mô đuôi Vƣờn thú Lào, Viêng Chăn 52 C. cf. siamensis Cr59 Lao Zoo 11 mô đuôi Vƣờn thú Lào, Viêng Chăn 53 C. cf. siamensis Cr60 Lao Zoo 1 mô đuôi Vƣờn thú Lào, Viêng Chăn 54 C. cf. siamensis Cr61 Lao Zoo 10 mô đuôi Vƣờn thú Lào, Viêng Chăn 55 C. cf. siamensis Cr62 Lao Zoo 12 mô đuôi Vƣờn thú Lào, Viêng Chăn 56 C. cf. siamensis Cr63 Lao Zoo 3 mô đuôi Vƣờn thú Lào, Viêng Chăn 57 C. cf. siamensis Cr64 Lao Zoo 16 mô đuôi Vƣờn thú Lào, Viêng Chăn 58 C. cf. siamensis Cr65 Lao Zoo 13 mô đuôi Vƣờn thú Lào, Viêng Chăn 59 C. cf. siamensis Cr66 Lao Zoo 17 mô đuôi Vƣờn thú Lào, Viêng Chăn 60 C. cf. siamensis Cr67 Lao Zoo CS20 mô đuôi Vƣờn thú Lào, Viêng Chăn 61 C. cf. siamensis Cr68 Lao Zoo CS21 mô đuôi Vƣờn thú Lào, Viêng Chăn 62 C. cf. siamensis Cr69 Lao Zoo CS22 mô đuôi Vƣờn thú Lào, Viêng Chăn 63 C. cf. siamensis Cr70 Lao Zoo CS23 mô đuôi Vƣờn thú Lào, Viêng Chăn 64 C. cf. siamensis Cr71 Lao Zoo CS24 mô đuôi Vƣờn thú Lào, Viêng Chăn 65 C. cf. siamensis Cr72 Lao Zoo CS25 mô đuôi Vƣờn thú Lào, Viêng Chăn 66 C. siamensis Cr95 S1 máu Vƣờn thú Plzen, Séc 67 C. siamensis Cr96 S2 máu Vƣờn thú Plzen, Séc 68 C. siamensis Cr97 S3 máu Vƣờn thú Plzen, Séc
69 C. siamensis Cr98 COS002 máu Vƣờn thú Benidorm, Tây Ban Nha 70 C. cf. siamensis Cr100 COS003 máu Vƣờn thú Benidorm, Tây Ban Nha 71 C. siamensis Cr77 CT.2018.1 mô đuôi Vƣờn quốc gia Cát Tiên
72 C. siamensis Cr78 CT.2018.2 mô đuôi Vƣờn quốc gia Cát Tiên 73 C. siamensis Cr79 CT.2018.3 mô đuôi Vƣờn quốc gia Cát Tiên 74 C. siamensis Cr80 CT.2018.4 mô đuôi Vƣờn quốc gia Cát Tiên
77 C. porosus Cp2 máu Vƣờn thú Wilhelma, Đức 78 C. porosus Cp3 máu Vƣờn thú Wilhelma, Đức 79 C. porosus Cp4 máu Vƣờn thú Wilhelma, Đức 80 C. porosus Cp5 máu Vƣờn thú Wilhelma, Đức 81 C. rhombifer Crb1 mô đuôi Vƣờn thúZagreb, Croatia 82 C. rhombifer Crb2 mô đuôi Terrariet Vissenbjerg, Đan Mạch 83 C. rhombifer Crb3 mô đuôi Vƣờn thú Hoyerswerda, Đức 84 C. rhombifer Crb4 mô đuôi Vƣờn thú Hoyerswerda, Đức 85 C. rhombifer Crb5 mô đuôi Vƣờn thú Hoyerswerda, Đức
Hoá chất và thiết bị sử dụng
- Các hoá chất, bộ Kit đƣợc sử dụng trong nghiên cứu bao gồm:
- Tách chiết ADN: Kit Dneasy Blood and Tissue (Qiagen, Đức), GeneJET
Genomic DNA Purification Kit (Thermo Fisher), Ethanol (Merck, Đức)
- PCR: Dream Taq Master Mix (Thermo Fisher), các mồi đánh dấu huỳnh
quang (FAM, HEX) và mồi không đánh dấu (Bảng 2)
- Điện di: Đệm TBE 10X với công thức pha 250ml: 27g Tris Base Sigma,
13,75g Boric Acid Merck và 1,875g EDTA Merck.
- Ethidium bromide của Invitrogen, gel agarose (Invitrogen), marker 100bp,
1kb (Thermo Fisher)
- Tinh sạch sản phẩm PCR: Kit GeneJET PCR Purification (Thermo Fisher)
- Thiết bị đƣợc sử dụng trong nghiên cứu có tại Phịng thí nghiệm Bộ mơn Di
truyền học, Khoa Sinh học, trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội bao gồm: bể ổn nhiệt, máy li tâm Hettich Mikro 22R, Máy PCR SimpliAmp™ Thermal Cycler, máy soi gel, bể điện di Bio-RAD, pipet các loại.