CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tạo dữ liệu di truyền cho quần thể mới tại Lào
3.2.1. Xác định dòng mẹ
Do mẫu vật có nồng độ ADN cao nên chúng tôi đã khuếch đại thành công các mẫu cần xác định độ thuần chủng. Băng điện di của các mẫu này có kích thƣớc đúng với đoạn gen ty thể mong muốn, có đủ độ sáng để thực hiện phản ứng giải trình tự (Hình 4).
Hình 4. Ảnh điện di sản phẩm PCR các mẫu Cr21, Cr22, Cr23, Cr24 và đối chứng
âm khuếch đại đoạn gen ty thể trên gel Agarose 1%, TBE 1X
Sản phẩm PCR sau khi đƣợc tinh sạch và giải trình tự cho kết quả tốt, tín hiệu của nhận đƣợc rõ ràng, ít xảy ra sự chồng lên nhau của các tín hiệu (Hình 5).
Hình 5. Tín hiệu tốt trong kết quả giải trình tự
Ở khoảng 20-30 nucleotide đầu tiên và cuối cùng của trình tự, tín hiệu thƣờng bị nhiễu, các đỉnh có thể bị chồng lên nhau, chƣa nhận biết đƣợc nucleotide (Hình 6). Đoạn trình tự bị nhiễu này sẽ đƣợc loại bỏ bằng phần mềm Sequencherv5.4.
Hình 6. Tín hiệu nhiễu ở đoạn đầu của phản ứng giải trình tự
Sau q trình giải trình tự và xử lý, tơi đã thu đƣợc trình tự đoạn gen ty thể mong muốn với độ tin cậy cao. Các trình tự này đƣợc đối chiếu với các trình tự trên ngân hàng gen (NCBI) để đƣa ra kết luận về nguồn gốc dòng mẹ của từng cá thể.
Kết quả blast cho thấy chính xác nguồn gốc dịng mẹ của các cá thể cá sấu Xiêm bởi có sự tƣơng đồng cao (99 - 100%). Các mẫu vật của cá sấu Cuba (C. rhombifer) và cá sấu nƣớc mặn (C. porosus) cũng có độ tƣơng đồng cao (99 - 100%) với loài tƣơng ứng. Các cá thể cần xác định mức độ thuần chủng đều có độ tƣơng đồng cao (99 - 100%) với C. siamensis.
Nhƣ vậy các cá thể cần xác định mức độ thuần chủng đều có nguồn gốc dòng mẹ là C. siamensis đƣợc tiếp tục phân tích để xác định mức độ thuần chủng.
3.2.2. Khuếch đại các locus của chỉ thị microsatellite
Phản ứng PCR cho băng điện di kiểm tra có độ sáng tƣơng đối tốt, đúng kích thƣớc đoạn gen cần khuếch đại với hầu hết các mẫu và các locus. Tuy nhiên một số mẫu không thể khuếch đại đƣợc locus Cj131 và Cr 391 (Hình 7).
Hình 7. Ảnh điện di sản phẩm PCR các mẫu Cr21, Cr22, Cr23, Cr24 và đối chứng
âm khuếch đại hai locus microsatellite trên gel Agarose 1%, TBE 1X (Kí hiệu .391: sản phẩm khuếch đại với cặp mồi Cr391F-Cr391R; Kí hiệu .16: là sản phẩm khuếch
Các sản phẩm PCR với màu và kích thƣớc khác nhau đƣợc kết hợp lại và xác định kiểu gen với 8 locus microsatellite. Kết quả xác định kiểu gen cho tín hiệu tốt, rõ ràng (Hình 8,9). Chúng tơi đã kết hợp các locus nhƣ sau: Cj16 - Cj18 - Cj101; Cj104 - Cj119; Cj131 - Cp10 - Cr391.
Hình 8. Tín hiệu kiểu gen của locus Cj18 đƣợc đánh dấu huỳnh quang bằng HEX
Hình 9. Tín hiệu kiểu gen của locus Cj16 và Cj101 đƣợc đánh dấu huỳnh quang
bằng FAM
Kiểu gen đƣợc xác định dựa trên một thang có trƣớc nên chiều dài đoạn microsatellite sẽ chứa phần thập phân (Hình 10). Tín hiệu nhiều lúc bị nhiễu bởi các đoạn có kích thƣớc khơng chính xác chiếm nồng độ nhỏ trong phản ứng PCR, primer dimer. Các vấn đề này đƣợc xử lý bằng phần mềm GeneMapper4.0 và GeneMarkerv2.4.6 để đƣa ra kết quả chính xác về kiểu gen.
Hình 10. Thang đo để xác định kích thƣớc alen
Nhƣ vậy, sau quá trình khuếch đại và xử lý dữ liệu, chúng tôi thu đƣợc các kiểu gen của 8 locus microsatellite với độ tin cậy cao để tiến hành các phân tích tiếp theo. Các locus khơng thể xác định kiểu gen sẽ đƣợc xác nhận là thiếu dữ liệu (missing data) trong các phân tích.
3.2.3. Phân tích xác suất thuộc về nhóm thuần chủng
Phân tích bằng phần mềm GeneClassv2.0 cho xác suất thuộc về nhóm cá thể thuần chủng (Bảng 4). Giá trị này với các cá thể cá sấu nƣớc mặn và Cuba hầu hết là 0%. Khoảng giá trị này đối với các cá thể cần xác định mức độ thuần chủng là: với phƣơng pháp Bayesian 0 - 80,17%; phƣơng pháp khoảng cách là 0 - 98,78%; phƣơng pháp tần số là 0 - 86,06%. Các giá trị này không tỷ lệ thuận giữa các mẫu.
Bảng 4. Kết quả phân tích dữ liệu microsatellite bằng phần mềm GeneClassv2.0 thể
hiện xác suất thuộc về nhóm cá thể thuần chủng
STT Tên lồi Kí hiệu Kí hiệu ngồi Phƣơng pháp Phƣơng pháp Phƣơng pháp Địa điểm PTN thực địa Bayesian khoảng cách tần số
1 C. cf. siamensis Cr1 46,03 75,15 87,05 Kiên Giang: Hòn Me 2 C. cf. siamensis Cr7 Bs1 0,41 51,93 0,86 Tỉnh Khammouane, Lào 3 C. cf. siamensis Cr8 Bs2 0,41 51,93 0,86 Tỉnh Khammouane, Lào 4 C. cf. siamensis Cr9 Bs3 2,97 93,42 4,19 Tỉnh Khammouane, Lào 5 C. cf. siamensis Cr10 Saigon 1 0,02 1,55 0,13 Vƣờn thú Sài Gòn 6 C. cf. siamensis Cr11 Saigon 2 4,89 33,96 20,32 Vƣờn thú Sài Gòn 7 C. cf. siamensis Cr12 Saigon 3 0,01 32,80 0,03 Vƣờn thú Sài Gòn 8 C. cf. siamensis Cr13 Saigon 4 0,35 34,02 2,52 Vƣờn thú Sài Gòn 9 C. cf. siamensis Cr14 Saigon 5 0,93 33,72 5,97 Vƣờn thú Sài Gòn 10 C. cf. siamensis Cr15 Saigon 6 24,39 18,82 50,88 Vƣờn thú Sài Gòn 11 C. cf. siamensis Cr16 Saigon 7 0,38 25,57 2,14 Vƣờn thú Sài Gòn 12 C. cf. siamensis Cr17 Saigon 8 0,01 32,26 0,03 Vƣờn thú Sài Gòn 13 C. cf. siamensis Cr18 Saigon 9 33,53 50,30 70,08 Vƣờn thú Sài Gòn 14 C. cf. siamensis Cr19 Saigon 10 28,54 40,88 62,48 Vƣờn thú Sài Gòn 15 C. cf. siamensis Cr20 Saigon 11 8,02 31,50 27,12 Vƣờn thú Sài Gòn 16 C. cf. siamensis Cr21 Saigon 12 0,57 6,18 2,74 Vƣờn thú Sài Gòn 17 C. cf. siamensis Cr22 Saigon 13 0,11 7,74 1,03 Vƣờn thú Sài Gòn
19 C. cf. siamensis Cr24 Saigon 15 0,00 31,01 0,00 Vƣờn thú Sài Gòn 20 C. cf. siamensis Cr25 Saigon 16 0,00 1,70 0,00 Vƣờn thú Sài Gòn 21 C. cf. siamensis Cr26 Saigon 17 0,00 7,33 0,00 Vƣờn thú Sài Gòn 22 C. cf. siamensis Cr27 Saigon 18 0,00 0,25 0,00 Vƣờn thú Sài Gòn 23 C. cf. siamensis Cr28 Saigon 19 2,38 1,10 14,95 Vƣờn thú Sài Gòn 24 C. cf. siamensis Cr29 Saigon 20 0,08 0,06 1,01 Vƣờn thú Sài Gòn 25 C. cf. siamensis Cr30 Saigon 21 28,92 29,08 69,27 Vƣờn thú Sài Gòn 26 C. cf. siamensis Cr31 Saigon 22 0,02 2,77 0,69 Vƣờn thú Sài Gòn 27 C. cf. siamensis Cr32 Saigon 23 28,52 37,92 59,51 Vƣờn thú Sài Gòn 28 C. cf. siamensis Cr33 Saigon 24 55,14 20,58 95,66 Vƣờn thú Sài Gòn 29 C. cf. siamensis Cr34 Saigon 25 3,40 63,09 5,29 Vƣờn thú Sài Gòn 30 C. cf. siamensis Cr35 Saigon 26 7,76 27,52 25,33 Vƣờn thú Sài Gòn 31 C. cf. siamensis Cr36 Saigon 27 32,81 72,66 68,01 Vƣờn thú Sài Gòn 32 C. cf. siamensis Cr37 Saigon 28 15,62 30,39 39,50 Vƣờn thú Sài Gòn 33 C. cf. siamensis Cr38 Hanoi 41 0,22 25,09 3,33 Vƣờn thú Thủ Lệ 34 C. cf. siamensis Cr39 Hanoi 30 68,67 86,36 99,69 Vƣờn thú Thủ Lệ 35 C. cf. siamensis Cr40 Hanoi 31 0,00 14,69 0,00 Vƣờn thú Thủ Lệ 36 C. cf. siamensis Cr41 Hanoi 32 36,82 24,72 82,48 Vƣờn thú Thủ Lệ 37 C. cf. siamensis Cr42 Hanoi 33 0,05 13,73 0,29 Vƣờn thú Thủ Lệ 38 C. cf. siamensis Cr43 Hanoi 34 2,27 28,36 5,21 Vƣờn thú Thủ Lệ 39 C. cf. siamensis Cr44 Hanoi 35 14,81 59,75 38,17 Vƣờn thú Thủ Lệ 40 C. cf. siamensis Cr45 Hanoi 36 18,61 38,70 50,07 Vƣờn thú Thủ Lệ 41 C. cf. siamensis Cr46 Hanoi 37 19,59 18,22 51,02 Vƣờn thú Thủ Lệ 42 C. cf. siamensis Cr47 Hanoi 38 12,40 67,26 31,87 Vƣờn thú Thủ Lệ 43 C. cf. siamensis Cr48 Hanoi 39 0,11 65,98 1,03 Vƣờn thú Thủ Lệ 44 C. cf. siamensis Cr49 Hanoi 40 55,12 33,78 93,62 Vƣờn thú Thủ Lệ 45 C. cf. siamensis Cr50 Lao Zoo 5 51,13 56,52 63,72 Vƣờn thú Lào, Viêng Chăn 46 C. cf. siamensis Cr53 Lao Zoo 14 0,32 0,01 2,95 Vƣờn thú Lào, Viêng Chăn 47 C. cf. siamensis Cr54 Lao Zoo 18 0,00 21,81 0,02 Vƣờn thú Lào, Viêng Chăn 48 C. cf. siamensis Cr55 Lao Zoo 19 15,07 93,60 34,56 Vƣờn thú Lào, Viêng Chăn 49 C. cf. siamensis Cr56 Lao Zoo 15 0,00 9,37 0,02 Vƣờn thú Lào, Viêng Chăn 50 C. cf. siamensis Cr57 Lao Zoo 2 28,08 53,56 62,72 Vƣờn thú Lào, Viêng Chăn 51 C. cf. siamensis Cr58 Lao Zoo 4 34,51 45,68 78,50 Vƣờn thú Lào, Viêng Chăn 52 C. cf. siamensis Cr59 Lao Zoo 11 0,16 0,05 1,62 Vƣờn thú Lào, Viêng Chăn 53 C. cf. siamensis Cr60 Lao Zoo 1 1,41 65,06 4,36 Vƣờn thú Lào, Viêng Chăn 54 C. cf. siamensis Cr61 Lao Zoo 10 39,20 31,94 85,11 Vƣờn thú Lào, Viêng Chăn 55 C. cf. siamensis Cr62 Lao Zoo 12 0,00 30,92 0,21 Vƣờn thú Lào, Viêng Chăn 56 C. cf. siamensis Cr63 Lao Zoo 3 51,93 43,69 93,33 Vƣờn thú Lào, Viêng Chăn 57 C. cf. siamensis Cr64 Lao Zoo 16 0,52 64,30 3,95 Vƣờn thú Lào, Viêng Chăn 58 C. cf. siamensis Cr65 Lao Zoo 13 44,65 21,84 83,41 Vƣờn thú Lào, Viêng Chăn 59 C. cf. siamensis Cr66 Lao Zoo 17 0,00 79,21 0,17 Vƣờn thú Lào, Viêng Chăn 60 C. cf. siamensis Cr67 Lao Zoo CS20 4,14 27,18 19,38 Vƣờn thú Lào, Viêng Chăn 61 C. cf. siamensis Cr68 Lao Zoo CS21 0,00 23,92 0,00 Vƣờn thú Lào, Viêng Chăn 62 C. cf. siamensis Cr69 Lao Zoo CS22 6,80 41,25 21,84 Vƣờn thú Lào, Viêng Chăn 63 C. cf. siamensis Cr70 Lao Zoo CS23 1,91 75,08 13,57 Vƣờn thú Lào, Viêng Chăn 64 C. cf. siamensis Cr71 Lao Zoo CS24 35,58 62,02 80,03 Vƣờn thú Lào, Viêng Chăn 65 C. cf. siamensis Cr72 Lao Zoo CS25 31,38 73,72 69,54 Vƣờn thú Lào, Viêng Chăn 66 C. siamensis Cr95 S1 78,30 88,65 86,12 Vƣờn thú Plzen, Séc 67 C. siamensis Cr96 S2 28,33 82,63 68,51 Vƣờn thú Plzen, Séc
69 C. siamensis Cr98 COS002 20,17 5,81 49,83 Vƣờn thú Benidorm, Tây Ban Nha 70 C. cf. siamensis Cr 100 COS003 0,00 41,83 0,00 Vƣờn thú Benidorm, Tây Ban Nha 71 C. siamensis Cr77 CT.2018.1 24,56 15,55 31,76 Vƣờn quốc gia Cát Tiên
72 C. siamensis Cr78 CT.2018.2 4,59 82,71 6,98 Vƣờn quốc gia Cát Tiên 73 C. siamensis Cr79 CT.2018.3 0,62 73,29 1,52 Vƣờn quốc gia Cát Tiên 74 C. siamensis Cr80 CT.2018.4 32,89 47,03 39,16 Vƣờn quốc gia Cát Tiên
75 C. cf. siamensis Cr 99 COS004 0,00 37,89 0,00 Vƣờn thú Benidorm, Tây Ban Nha 76 C. porosus Cp1 0 0 0 Vƣờn thú Wilhelma, Đức 77 C. porosus Cp2 0 0 0 Vƣờn thú Wilhelma, Đức 78 C. porosus Cp3 0 0 0 Vƣờn thú Wilhelma, Đức 79 C. porosus Cp4 0 0 0 Vƣờn thú Wilhelma, Đức 80 C. porosus Cp5 0 0 0 Vƣờn thú Wilhelma, Đức 81 C. rhombifer Crb1 0 0 0 Vƣờn thúZagreb, Croatia 82 C. rhombifer Crb2 0 0 0 Terrariet Vissenbjerg, Đan Mạch 83 C. rhombifer Crb3 0 0 0 Vƣờn thú Hoyerswerda, Đức 84 C. rhombifer Crb4 0 0 0 Vƣờn thú Hoyerswerda, Đức 85 C. rhombifer Crb5 0 1,9742 0 Vƣờn thú Hoyerswerda, Đức
Phân tích bằng phần mềm GeneClassv2.0 cho kết quả không đƣợc thống nhất giữa các phƣơng pháp chạy. Một số mẫu thuần chủng có xác suất thuộc vào nhóm thuần chủng rất thấp (dƣới 10%) ở một hoặc hai phƣơng pháp nhƣ Cr 53, Cr79, Cr 98. Ngun nhân của điều này có thể là vì lƣợng mẫu đƣợc xác nhận thuần chủng hiện tại chƣa đủ (13 mẫu) nên dữ liệu quần thể để tham khảo ít, chƣa đủ tính chất đại diện. Thêm vào đó sự thuần chủng của các mẫu thuần chủng chỉ đƣợc xác nhận bởi chủ trang trại mà chƣa có cơ sở khoa học. Do vậy việc xác định mức độ thuần chủng trong nghiên cứu này sẽ phụ thuộc chủ yếu vào tỷ lồi đƣợc phân tích bằng phần mềm STRUCTUREv2.3.4.
3.2.4. Phân tích tỷ lệ lồi trong từng cá thể
Tại các địa điểm nghiên cứu, hai lồi có khả năng lai với cá sấu Xiêm
(Crococdylus siamensis) là cá sấu nƣớc mặn (C. porosus) và cá sấu Cuba (C. rhombifer) nên chúng tôi tiến hành xác định tỷ lệ của ba loài này trong từng cá thể.
Phần mềm STRUCTUREv2.3.4 đƣợc chạy với các giá trị K (số nhóm) khác nhau. Tuy nhiên việc dùng Structure Harvester [23] để lựa chọn giá trị K là không hợp lí bởi số lƣợng cá thể thuần chủng chắc chắn và các loài lai cùng (C. porosus và
C. rhombifer) chƣa đủ lớn nên khơng đủ tính đại diện và khó để tách đƣợc thành ba
Hình 11. Biểu đồ phân tích với bộ dữ liệu microsatellite với K=3
Kết quả cho thấy các cá thể cần xác định đều có phần tỷ lệ của lồi cá sấu Xiêm (C. siamensis) cao từ 88,6% đến 99,6%, trong đó số lƣợng có tỷ lệ trên 99% là 52/65 chiếm 80%. Tỷ lệ loài tƣơng ứng của các cá thể cá sấu nƣớc mặn thuần chủng (C. porosus) có giá trị từ 99,4% đến 99,5%; giá trị này của các cá thể cá sấu
Cuba thuần chủng (C. rhombifer) là 97,7% đến 99,5% và các cá thể cá sấu Xiêm
thuần chủng (C. siamensis) là 99,5% đến 99,6%. Kết quả đƣợc thể hiện ở Hình 11 và thống kê cụ thể ở Bảng 5.
Bảng 5. Kết quả phân tích dữ liệu microsatellite bằng phần mềm STRUCTURE
v2.3.4. Các mẫu tơ đỏ là mẫu có khả năng khơng thuần chủng cao
STT Tên lồi Kí hiệu Kí hiệu ngồi Tỷ lệ Tỷ lệ Tỷ lệ Địa điểm PTN thực địa C. siamensis C. porosusC. rhombifer
1 C. cf. siamensis Cr1 99.6 0.2 0.2 Kiên Giang: Hòn Me
2 C. cf. siamensis Cr7 Bs1 99.6 0.2 0.2 Tỉnh Khammouane, Lào
3 C. cf. siamensis Cr8 Bs2 99.6 0.2 0.2 Tỉnh Khammouane, Lào
4 C. cf. siamensis Cr9 Bs3 99.4 0.3 0.3 Tỉnh Khammouane, Lào
5 C. cf. siamensis Cr10 Saigon 1 99.6 0.2 0.2 Vƣờn thú Sài Gòn
6 C. cf. siamensis Cr11 Saigon 2 98.3 0.8 0.9 Vƣờn thú Sài Gòn
7 C. cf. siamensis Cr12 Saigon 3 99.4 0.2 0.3 Vƣờn thú Sài Gòn 8 C. cf. siamensis Cr13 Saigon 4 99.6 0.2 0.2 Vƣờn thú Sài Gòn 9 C. cf. siamensis Cr14 Saigon 5 99.5 0.2 0.2 Vƣờn thú Sài Gòn 10 C. cf. siamensis Cr15 Saigon 6 99.3 0.4 0.3 Vƣờn thú Sài Gòn
11 C. cf. siamensis Cr16 Saigon 7 98.6 1.1 0.2 Vƣờn thú Sài Gòn
12 C. cf. siamensis Cr17 Saigon 8 99.5 0.2 0.3 Vƣờn thú Sài Gòn 13 C. cf. siamensis Cr18 Saigon 9 99.6 0.2 0.2 Vƣờn thú Sài Gòn 14 C. cf. siamensis Cr19 Saigon 10 99.6 0.2 0.2 Vƣờn thú Sài Gòn 15 C. cf. siamensis Cr20 Saigon 11 99.6 0.2 0.2 Vƣờn thú Sài Gòn 16 C. cf. siamensis Cr21 Saigon 12 99.6 0.2 0.2 Vƣờn thú Sài Gòn
17 C. cf. siamensis Cr22 Saigon 13 99.0 0.4 0.5 Vƣờn thú Sài Gòn
18 C. cf. siamensis Cr23 Saigon 14 99.6 0.2 0.2 Vƣờn thú Sài Gòn
21 C. cf. siamensis Cr26 Saigon 17 97.1 1.0 1.9 Vƣờn thú Sài Gòn 22 C. cf. siamensis Cr27 Saigon 18 97.4 1.0 1.6 Vƣờn thú Sài Gòn
23 C. cf. siamensis Cr28 Saigon 19 99.3 0.3 0.4 Vƣờn thú Sài Gòn
24 C. cf. siamensis Cr29 Saigon 20 97.5 2.0 0.5 Vƣờn thú Sài Gòn
25 C. cf. siamensis Cr30 Saigon 21 99.6 0.2 0.2 Vƣờn thú Sài Gòn
26 C. cf. siamensis Cr31 Saigon 22 98.4 0.6 1.0 Vƣờn thú Sài Gòn
27 C. cf. siamensis Cr32 Saigon 23 99.6 0.2 0.2 Vƣờn thú Sài Gòn 28 C. cf. siamensis Cr33 Saigon 24 99.6 0.2 0.2 Vƣờn thú Sài Gòn 29 C. cf. siamensis Cr34 Saigon 25 99.6 0.2 0.2 Vƣờn thú Sài Gòn 30 C. cf. siamensis Cr35 Saigon 26 99.5 0.2 0.2 Vƣờn thú Sài Gòn 31 C. cf. siamensis Cr36 Saigon 27 99.6 0.2 0.2 Vƣờn thú Sài Gòn 32 C. cf. siamensis Cr37 Saigon 28 99.6 0.2 0.2 Vƣờn thú Sài Gòn 33 C. cf. siamensis Cr38 Hanoi 41 99.5 0.2 0.3 Vƣờn thú Thủ Lệ 34 C. cf. siamensis Cr39 Hanoi 30 99.6 0.2 0.2 Vƣờn thú Thủ Lệ 35 C. cf. siamensis Cr40 Hanoi 31 99.2 0.3 0.4 Vƣờn thú Thủ Lệ 36 C. cf. siamensis Cr41 Hanoi 32 99.6 0.2 0.2 Vƣờn thú Thủ Lệ 37 C. cf. siamensis Cr42 Hanoi 33 95.7 2.5 1.8 Vƣờn thú Thủ Lệ 38 C. cf. siamensis Cr43 Hanoi 34 99.6 0.2 0.2 Vƣờn thú Thủ Lệ 39 C. cf. siamensis Cr44 Hanoi 35 99.6 0.2 0.2 Vƣờn thú Thủ Lệ 40 C. cf. siamensis Cr45 Hanoi 36 99.6 0.2 0.2 Vƣờn thú Thủ Lệ 41 C. cf. siamensis Cr46 Hanoi 37 99.6 0.2 0.2 Vƣờn thú Thủ Lệ 42 C. cf. siamensis Cr47 Hanoi 38 99.6 0.2 0.2 Vƣờn thú Thủ Lệ 43 C. cf. siamensis Cr48 Hanoi 39 98.2 1.3 0.5 Vƣờn thú Thủ Lệ 44 C. cf. siamensis Cr49 Hanoi 40 99.6 0.2 0.2 Vƣờn thú Thủ Lệ 45 C. cf. siamensis Cr52 Lao Zoo 5 99.5 0.2 0.2 Vƣờn thú Lào, Viêng Chăn
46 C. cf. siamensis Cr53 Lao Zoo 14 96.7 2.4 0.9 Vƣờn thú Lào, Viêng Chăn 47 C. cf. siamensis Cr54 Lao Zoo 18 98.7 0.4 1.0 Vƣờn thú Lào, Viêng Chăn
48 C. cf. siamensis Cr55 Lao Zoo 19 99.5 0.2 0.2 Vƣờn thú Lào, Viêng Chăn