CHƢƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.2. Tách chiết ADN tổng số, PCR, tinh sạch, giải trình tự và xác định kiểu
Tách chiết ADN
Các mẫu đƣợc tách chiết ADN tổng số sử dụng 2 bộ kit: Kit Dneasy Blood and Tissue (Quiagen, Đức) và GeneJET Genomic DNA Purification Kit tùy thuộc vào loại mẫu. Quy trình tách chiết đƣợc tiến hành theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất, có chỉnh lý
Quy trình cụ thể nhƣ sau:
- QIAamp DNA Stool Mini Kit (Quiagen):
Bộ Kit này đƣợc sử dụng để tách chiết các mẫu phân với một vài thay đổi so với quy trình của nhà sản xuất cụ thể nhƣ sau:
Kiểm tra ASL, AL, và AE trƣớc khi tách chiết, tránh bị vón cục. Nếu hố
chất bị vón cục thì ủ trong bể ổn nhiệt ở 70oC. Máy ly tâm cần đƣợc cài đặt ở nhiệt
độ phòng.
Bƣớc 1: Tiền xử lý mẫu
Trộn đều thật mạnh mẫu khoảng 5 phút, loại bỏ các sợi hay cục to, cho vào một ống eppendorf mới.
Ly tâm vận tốc 20000 x rcf trong 5 phút ở nhiệt độ phòng.
Hút bỏ phần dịch nổi, dùng đầu tip gạt mỏng phần cặn lắng dọc theo chiều dài thành ống.
Mở nắp ống rồi đặt nằm ngang ống lên mặt phẳng và giữ mẫu ở 4˚C qua đêm. Nếu muốn rút ngắn thời gian thì để mẫu trong máy hút chân không trong 1 giờ sẽ khô.
Bƣớc này để nhằm loại bỏ hết cồn đƣợc dùng khi bảo quản mẫu để tránh ảnh hƣởng đến kết quả các bƣớc sau
Bƣớc 2: Ly giải tế bào
Bổ sung 10 lần đệm ASL so với lƣợng mẫu. (0,1g mẫu cần bổ sung 1ml đệm ASL), trộn mạnh mẫu khoảng 3 – 5 phút cho vỡ hết mảnh lớn của phân.
Ủ mẫu ở 4˚C trong 4 ngày. Trong quá trình ủ thƣờng xuyên trộn đều hỗn hợp. Lấy 2 ml dịch, ly tâm vận tốc 20000 x rcf trong 1 phút ở nhiệt độ phòng.
Lấy 1,4 ml dịch nổi, bổ sung 1 viên InhibitEx, trộn mẫu mạnh trong 3 phút đến khi dung dịch đồng nhất.
Ủ mẫu ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.
Ly tâm vận tốc 20000 x rcf trong 6 phút ở nhiệt độ phịng. Lấy 600 µl dịch nổi, bổ sung 35 µl Proteinase K.
Ủ mẫu ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Bƣớc 3: Kết tủa ADN
Bổ sung 600 µl đệm AL. Trộn đều hỗn hợp, ủ mẫu ở 70˚C trong 15 phút. Bổ sung 600 µl cồn (96 – 100%), trộn nhẹ hỗn hợp
Bƣớc 4: Thu ADN trên cột
Chuyển 600 µl hỗn hợp sang cột lọc DNeasy Mini Spin Columns 2ml. Ly tâm vận tốc 20000 x rcf trong 1 phút.
Loại bỏ dung dịch trong ống xả Lặp lại bƣớc này 2 lần.
Bƣớc 5: Rửa mẫu Thay ống xả.
Bổ sung 500 µl đệm AW2, ly tâm vận tốc 20000 x rcf trong 1 phút, loại bỏ dịch lọc. Bƣớc 6: Làm khô màng lọc
Ly tâm khô vận tốc 20000 x g trong 1 phút. Bƣớc 7: Thu ADN
Chuyển cột lọc sang ống eppendorf 1,5ml. Bổ sung 60 µl đệm AE.
Ủ mẫu ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Ly tâm vận tốc 20000 x rcf trong 1 phút.
Thu DNA trong dịch sau ly tâm và bảo quản ở 4oC.
- GeneJET Genomic DNA Purification Kit: Bộ kit này đƣợc sử dụng để tách các mẫu mơ có chất lƣợng tốt. Quy trình tách chiết cụ thể đƣợc thực hiện nhƣ sau.
Trƣớc khi thực hiện cần chú ý: Ủ các dung dịch đệm trong trƣờng hợp dung dịch bị kết tủa, ly tâm ở nhiệt độ phòng.
Bƣớc 1: Ly giải tế bào
Cắt 10mg mẫu thành những mảnh nhỏ, để khô, cho vào ống eppendorf 1,5ml.
Bổ sung 180 µl dung dịch Digestion Solution và 20 µl Proteinase K, trộn đều hỗn hợp.
Ủ mẫu ở 56oC trong 3 giờ.
Trong quá trình ủ thƣờng xuyên trộn đều hỗn hợp. Bƣớc 2: Loại bỏ ARN
Bổ sung 20 µl Rnase A Solution, trộn đều hỗn hợp. Ủ mẫu ở nhiệt độ phòng trong 10 phút.
Bƣớc 3: Kết tủa ADN
Bổ sung 400 µl cồn 50%, trộn nhẹ hỗn hợp. Bƣớc 4: Thu ADN trên cột
Chuyển toàn bộ hỗn hợp sang cột lọc GeneJET Genomic DNA Purification Column,
Ly tâm vận tốc 6000 x rcf trong 1 phút ở nhiệt độ phòng. Thay ống xả
Bổ sung 500 Wash Buffer I, ly tâm vận tốc 8000 x g trong 1 phút, loại bỏ dịch lọc. Bổ sung 500 µl Wash Buffer II, ly tâm vận tốc 12000 x g trong 1 phút 30 giây, loại bỏ dịch lọc.
Bƣớc 6: Làm khô màng lọc
Ly tâm vận tốc 8000 x g trong 1 phút ở nhiệt độ phòng. Bƣớc 7: Thu ADN
Chuyển cột lọc sang ống eppendorf 1.5 ml. Bổ sung 60 µl đệm Elution.
Ủ mẫu ở nhiệt độ phòng trong 10 phút.
Ly tâm vận tốc 8000 x rcf trong 1phút ở nhiệt độ phòng.
Thu mẫu và bảo quản ở 4oC.
PCR
Phản ứng PCR đƣợc sử dụng để khuếch đại các đoạn microsatellite và đoạn gen ty thể.
Microsatellite
Tám locus microsatellite đã đƣợc khuếch đại với tổng thể tích 24,7 µl bao gồm 1,7 µl khn; 1,5 µl mỗi chiều mồi; 7,5 µl H2O; và 12,5 µl Dream Taq Mastermix hoặc HotStar Taq Mastermix. Trình tự mồi đƣợc thể hiện ở Bảng 2.
Điều kiện phản ứng PCR: 95oC trong 15 phút với HotStar Taq (Qiagen) và 5 phút
với Dream Taq Mastermix (Thermo Fisher) để hoạt hoá Taq, 35 chu kỳ gồm; 95oC
trong 30 giây, 54 - 62oC trong 30 giây, 72oC trong 40 giây, và bƣớc kéo dài cuối 72oC trong 6 phút.
Các mồi để khuếch đại các đoạn microsatellite đƣợc gắn huỳnh quang với hai màu là HEX và FAM ở một chiều xi.
Bảng 2. Trình tự các mồi microsatellite sử dụng trong nghiên cứu
Primer Trình tự mồi Nguồn tham khảo
Cj16 F: CAT GCA GAT TGT TAT TCC TGA TG (FAM) FitzSimmons và cộng sự (2000)
R: TGT CAT GGT GTC AAT TAA ACT C FitzSimmons và cộng sự (2000)
Cj18 F: ATC CAA ATC CCA TGA ACC TGA GAG (HEX) FitzSimmons và cộng sự (2000)
R: CCG AGT GCT TAC AAG AGG CTG G FitzSimmons và cộng sự (2000)
Cj101 F: ACA GGA GGA ATG TCG CAT AAT TG (FAM) FitzSimmons và cộng sự (2000)
R: GTT TAT ACC GTG CCA TCC AAG TTA G FitzSimmons và cộng sự (2000)
Cj104 F: TCC TTC CAT GCA TGC ACG TGT G (HEX) FitzSimmons và cộng sự (2000)
R: GTT TCA GTG TCT GGT ATT GGA GAA GG FitzSimmons và cộng sự (2000)
Cj119 F: GTT TGC TGT GGA ATG TTT CTA C (HEX) FitzSimmons và cộng sự (2000)
R: CGC TAT ATG AAA CGG TGG CTG FitzSimmons và cộng sự (2000)
Cj131 F: GTT TGT CTT CTT CCT CCT GTC CCT C (FAM) FitzSimmons và cộng sự (2000)
R: AAA TGC TGA CTC CTA CGG ATG G FitzSimmons và cộng sự (2000)
Cp10 F: GAT TAG TTT TAC GTG ACA TGC A (FAM) FitzSimmons và cộng sự (2000)
R: ACA TCA AGT CAT GGC AGG TGA G FitzSimmons và cộng sự (2000)
Cr391 F: ATG AGT CAG GTG GCA GGT TC (FAM) FitzSimmons và cộng sự (2000)
R: CAT AAA TAC ACT TTT GAG CAG CAG FitzSimmons và cộng sự (2000)
Ghi chú F: Mồi xuôi, R: Mồi ngƣợc
Đoạn gen ty thể
Đoạn gen ty thể đƣợc khuếch đại là một đoạn gen dài 790 bp bao gồm các đoạn tRNA-Thr, tRNA-Pro, tRNA-Phe và một phần đoạn D-loop đã đƣợc sử dụng trong nghiên cứu của FitzSimmons và cộng sự (2002) với trình tự nhƣ sau:
Mồi xi L15463: 5’–CGCTGGCCTTGTAAGACAGA–3’
Mồi ngƣợc H16260: 5’–CACTAAAATTACAGAAAAGCCGAC–3’
Tổng thể tích phản ứng là 21 µl bao gồm: 2 µl khn, 2 µl mỗi chiều mồi, 5 µl H2O, và 10 µl Dream Taq Mastermix hoặc HotStar Taq Mastermix. Điều kiện
phản ứng PCR: 95oC trong 15 phút với HotStar Taq (Qiagen) và 5 phút với Dream
Taq Mastermix (Thermo Fisher) để hoạt hoá Taq, 35 chu kỳ gồm; 95oC trong 30 giây, 50oC trong 45 giây, 72oC trong 1 phút, và bƣớc kéo dài cuối 72oC trong 6 phút. s
Điện di
Sản phẩm PCR đƣợc điện di trên gel agarose 1% với đệm TBE 1X (1 µl Dye pha Ethidium Bromide và 5 µl sản phẩm PCR). Sản phẩm có băng điện di sáng, đúng kích thƣớc đƣợc gửi giải trình tự bởi FirstBASE (Ma-lai-xi-a).
Tinh sạch sản phẩm PCR
Các mẫu giải trình tự cần đƣợc tinh sạch để loại bỏ các yếu tố gây ảnh hƣởng đến phản ứng giải trình tự. Quy trình tinh sạch cụ thể nhƣ sau:
Bƣớc 1: Chuyển sản phẩm PCR lên cột lọc Bổ sung 15 µl Binding Buffer.
Chuyển tồn bộ dịch sang cột lọc GeneJET Purification Column Ly tâm vận tốc 13000rpm trong 1 phút ở nhiệt độ phòng.
Bƣớc 2: Rửa mẫu
Bổ sung 500 µl Wash Buffer
Ly tâm vận tốc 13000rpm trong 1 phút ở nhiệt độ phịng. Loại bỏ dịch lọc.
Bƣớc 3: Làm khơ màng lọc
Ly tâm vận tốc 13000rpm trong 1 phút ở nhiệt độ phòng. Bƣớc 4: Thu ADN
Bổ sung 30 µl Elution Buffer
Ly tâm vận tốc 13000rpm trong 1 phút ở nhiệt độ phòng.
Xác định kiểu gen microsatellite
Sản phẩm PCR có băng điện di sáng, đúng kích thƣớc đƣợc gửi xác định kiểu gen bởi FirstBASE (Ma-lai-xi-a) với độ pha loãng đã đƣợc tối ƣu cho các nhóm locus.