2.2.1. Nuôi cấy vi khuẩn
Các mẫu vi khuẩn đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng thạch LB và cấy chuyển 2 tuần một lần, bảo quản ở 4oC. Vi khuẩn đƣợc nuôi cấy lắc ở nhiệt độ 37oC trong môi trƣờng LB đặc (môi trƣờng LB bổ sung 18g thạch/lít). Thời gian ni cấy
từ 16-20 giờ. Mẫu vi khuẩn đƣợc cấy trải hoặc cấy ria trên mơi trƣờng thạch, sau đó ni ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ.
2.2.2. Tách chiết các hợp chất thực vật thứ sinh trong dịch chiết
Các mẫu thực vật sau khi đƣợc rửa sạch sấy khô ở nhiệt độ 40-50oC sẽ đƣợc nghiền nhỏ thành bột và chiết trong các loại dung môi khác nhau gồm n-Hexane, Ethanol 80%, Ethyl acetate theo các bƣớc:
- Lấy 5g mẫu bột lá bổ sung 50ml dung môi n-Hexane. Hỗn hợp đƣợc siêu âm trong bể với thời gian 60 phút, sau đó dịch tiếp tục đƣợc ly tâm trong 2000 vòng trong 5 phút, lọc thu dịch chiết n-Hexane và cặn.
- 50 ml n-Hexan đƣợc bổ sung vào cặn, tiếp tục đƣợc siêu âm bằng tay 10 phút và ly tâm giống nhƣ trên, thu đƣợc dịch chiết n-Hexan lần hai và cặn. Gộp 2 lần chiết sau đó cô quay đƣợc cao chiết n-Hexan.
Đối với dung môi chiết là Ethanol 80% và Ethyl acetate bƣớc thực hiện giống nhƣ bƣớc làm n-Hexan. Các bƣớc chiết đƣợc trình bày ở hình 2.1, 2.2 và 2.3.
Dịch Bã
Chiết lần 1(50 ml) n-Hexane
Mẫu thực vật (5g)
Siêu âm bể 1 tiếng Ly tâm
Lọc
Dịch lọc 1 Siêu âm bằng tay 1 mẫu/10 phút
Lọc lần 2 Chiết lần 2 bổ sung 50 ml Ly tâm 2000 v/5phút Loại bỏ Bã Dịch lọc 2 Lọc Dịch lọc chung Cao n-Hexan Cơ quay
Hình 2.2. Quy trình thu dịch chiết và cao chiết các mẫu thực vật trong Ethanol 80% Dịch Bã Chiết lần 1(50 ml) Ethanol 80% Mẫu thực vật (5g)
Siêu âm bể 1 tiếng Ly
tâm
Lọc
Dịch lọc 1 Siêu âm bằng tay 1 mẫu/10
phút Lọc lần 2 Chiết lần 2 bổ sung 50 ml Ly tâm 2000 v/5phút Loại bỏ Bã Dịch lọc 2 Lọc Dịch lọc chung Cao Ethanol 80% Cơ quay
Hình 2.3. Quy trình thu dịch chiết và cao chiết các mẫu thực vật trong Ethyl acetate
2.2.3. Xác định khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch
Các chủng vi khuẩn kiểm định đƣợc cấy trải trên môi trƣờng LB thạch. Nguyên tắc: Phƣơng pháp đục lỗ thạch đƣợc sử dụng để xác định sự khuếch tán chất ức chế vi khuẩn trong đĩa thạch. Vị trí nào có chất ức chế sinh trƣởng vi khuẩn khuếch tán thì ở đó vi sinh vật kiểm định không tạo khuẩn lạc hay mật độ khuẩn lạc thấp, khơng mọc đƣợc và tạo vịng vơ khuẩn. Hoạt tính kháng sinh đƣợc xác định bằng hiệu số giữa đƣờng kính vịng vơ khuẩn và đƣờng kính lỗ đục.
Hoạt tính kháng khuẩn (mm) = D – d (mm). Trong đó:
D: đƣờng kính vịng vơ khuẩn d: đƣờng kính của lỗ thạch
Phƣơng pháp: dùng ống hút (d = 6 mm) khoan lỗ trên bề mặt thạch đã đƣợc
Dịch Bã
Chiết lần 1(50 ml) Ethyl acetate
Mẫu thực vật (5g)
Siêu âm bể 1 tiếng Ly tâm
tâm
Lọc
Dịch lọc 1 Siêu âm đầu dò 10phút/1 mẫu
phút Lọc lần 2
Chiết lần 2 bổ sung 50 ml MetOH
Ly tâm 2000 vòng /5phút Loại bỏ Bã Dịch lọc 2 Lọc Dịch lọc chung
Cao Ethyl acetate
thực vật. Sau đó, đặt các đĩa vào tủ lạnh 4oC trong vòng 2 giờ để chất kháng khuếch tán đều, rồi chuyển tiếp vào tủ ấm 37 oC để nuôi vi sinh vật kiểm định.
Đọc và phân tích kết quả sau 16-20 giờ.
2.2.4. Nghiên cứu định tính các thành phần một số hợp chất tự nhiên có trong
dịch chiết thực vật
Phƣơng pháp nhằm phát hiện những hợp chất tự nhiên có trong dịch chiết bằng các phản ứng màu đặc trƣng:
2.2.4.1. Định tính flavonoids [14]
Mẫu đƣợc pha trong Ethanol thêm vài giọt HCl đặc.
- Phản ứng với H2SO4: Cho dung dịch mẫu vào 2 ống nghiệm: một ống đối chứng, ống kia thêm vài giọt acid sunfuric đặc. Phản ứng cho màu vàng đậm cho thấy sự có mặt của flavon và flavonol, màu đỏ hay nâu cho thấy sự có mặt của chalcon và auron.
- Phản ứng định tính catechin: Nhỏ một giọt dung dịch mẫu lên giấy lọc, nhỏ
tiếp lên một giọt dung dịch vanilin trong HCl đặc. Kết quả cho màu đỏ son là phản ứng dƣơng tính.
2.2.4.2. Định tính polyphenol
Bằng NaOH 10% hoặc FeCl3 5%. Hịa tan mẫu trong mEthanol, ly tâm thu dịch trong. Nhỏ vài giọt NaOH 10%, nếu thấy xuất hiện màu vàng là dƣơng tính. Tƣơng tự, nhỏ vào dịch trong vài giọt FeCl3 5% nếu thấy xuất hiện màu xanh đen là dƣơng tính.
2.2.4.3. Định tính glycoside (Phƣơng pháp Keller-Killian).
Hóa chất cần dùng gồm có: dung dich A (50ml axit acetic loãng + 0,5ml dung dịch FeCl3 5%), dung dịch B (50ml H2SO4 đặc + 0,5ml dung dịch FeCl3 5%).
Cho dung dịch A vào mẫu chiết, lắc đều. Thêm dung dịch B với thể tích tƣơng đƣơng. Nếu thấy xuất hiện lớp màu đỏ giữa 2 lớp dung dịch là phản ứng dƣơng tính.
2.2.5. Định lượng polyphenol tổng số trong dịch chiết các mẫu thực vật [31]
Phản ứng định lƣợng polyphenol đƣợc sử dụng nhƣ theo mô tả trong Tiêu chuẩn Việt Nam.
Phương pháp: Đinh lƣợng hợp chất phenolics tổng số của dịch chiết ban đầu
theo phƣơng pháp Folin-Ciocalteau.
Nguyên tắc: Phƣơng pháp này đƣợc thực hiện dựa trên nguyên tắc các hợp chất phenolic trong dung dịch phản ứng với thuốc thử Folin-Ciocalteau cho sản phẩm màu xanh lam, đo độ hấp thụ ở bƣớc sóng 765 nm sử dụng axit gallic làm chất chuẩn.
Chuẩn bị:
+ Cân 10 mg mỗi loại cao và hịa lỗng trong 1ml Ethanol 90%
+ Dung dịch Na2CO3: 200g Na2CO3 + 800ml H2O đun sôi, thêm một vài tinh thể Na2CO3, sau 24h đem lọc và dẫn nƣớc cất tới 1000ml.
+ Dung dịch acid gallic + 10 ml C2H5OH +90 ml H2O bảo quản lạnh
+ Chuẩn bị 6 bình định mức 100 ml, sau đó cho vào mỗi bình 0, 1, 2, 3, 5 và 10ml acid gallic chuẩn , sau đó dẫn nƣớc cất tới 100 ml sẽ thu đƣợc dung dịch acid gallic các nồng độ 0, 50, 100, 150, 250, 500 mg/l. Dựng đƣờng chuẩn axit gallic.
2.2.6. Định lượng Flavonoids tổng số trong dịch chiết các mẫu thực vật
Tổng flavonoid đƣợc xác định theo phƣơng pháp so màu của Chang và cộng sự. (2002) [10] với nguyên tắc flavonoid trong các mẫu thực vật phản ứng với dung dịch AlCl3. Phản ứng này dùng để xác định hàm lƣợng flavonoid tổng có trong các mẫu thực vật. Cƣờng độ màu tỷ lệ thuận với hàm lƣợng flavonoid và đƣợc xác định ở bƣớc sóng 415 nm.
Đƣờng chuẩn: lấy 10 mg Quercetin hòa tan trong Ethanol 80% sau đó pha lỗng ra các nồng độ 25,50 và 100 µg/ml. Hút 0,5 ml dung dịch sau khi pha loãng bổ sung 1,5 ml, Ethanol 95%, 0,1 ml AlCl3, 0,1 ml CH3COOH và 2,8 ml nƣớc cất. Sau đó, hỗn hợp đƣợc lắc đều và để ổn định ở nhiệt độ phòng trong vòng 30 phút, rồi tiến hành so màu ở bƣớc sóng 415 nm trên máy đo quang phổ, mẫu đối chứng sử
Lấy 0,5 ml dịch chiết các mẫu thực vật và làm tƣơng tự nhƣ các bƣớc lập phƣơng trình đƣờng chuẩn, tổng flavonoid đƣợc xác định theo cơng thức:
F(%) = (a × V/m) × n × 10-6 × 100.
Trong đó, a là hàm lƣợng quercetin (µg/ml) đƣợc xác định từ phƣơng trình đƣờng chuẩn; V là tổng thể tích dịch chiết (mL); m là khối lƣợng mẫu (g); n là hệ số pha loãng.
2.2.7. Phân tách các thành phần các chất thực vật thứ sinh trong mẫu
2.2.7.1. Phương pháp sắc kí bản mỏng (TLC)
Phƣơng pháp sắc kí bản mỏng đƣợc sử dụng để phân tách và nhận biết các chất trong mẫu thực vật. Sắc ký lớp mỏng (TLC) đƣợc thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck). Dịch chiết thực vật đƣợc tiến hành chạy sắc ký bản mỏng 1 chiều (7×5cm) với hệ dung môi TEAF (Toluen: Ethylacetat: Axeton: Axit formic với tỉ lệ tƣơng ứng 5:3:1:1), phát hiện sắc ký đồ trong điều kiện ánh sáng thƣờng khi khơng phun thuốc thử và có phun thuốc thử đặc trƣng là dung dịch H2SO4 10% đƣợc phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng trên bề mặt bếp điện từ từ đến khi hiện màu. Các mẫu chất đƣợc quan sát rõ ràng hơn với máy quang phổ tại 2 bƣớc sóng 254 nm và 365 nm. Từ màu sắc của sắc ký đồ cho phép xác định sự có mặt của các chất trong dịch chiết.
2.2.8. Phương pháp xác định khả năng quét gốc tự do DPPH
Phƣơng pháp dùng để xác định khả năng ức chế gốc tự do của các chất chống oxi hố thơng qua sử dụng các gốc tự do bền vững, trong đó có DPPH trong dung mơi methanol. Phƣơng pháp nghiên cứu khả năng thu dọn gốc tự do DPPH đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp của Patel và cộng sự [28]. DPPH là các gốc tự do bền hấp thụ ở bƣớc sóng 517 nm.
Các bƣớc tiến hành:
4.3 mg DPPH đƣợc hoàn tan trong methanol (lƣu ý: cần bọc ống nghiệm bằng giấy bạc để bảo vệ DPPH)
Thêm 150µl dung dịch DPPH vào 3ml methanol, đem đo độ hấp thụ ở bƣớc sóng 517nm lấy làm giá trị control.
50 µl các nồng độ khác nhau của chất chuẩn Vitamin C đƣợc hòa tan trong methanol để đạt thể tích 150 µl.
Các dịch chiết mẫu thực vật đƣợc hịa tan trong methanol để đạt thể tích 3ml, sau đó thêm 150 µl DPPH.
Để các phản ứng xảy ra trong 30 phút, sau đó đo độ hấp thụ của chất chuẩn và các mẫu ở bƣớc sóng 517 nm với mẫu trắng là methanol.
Khả năng qt gốc tự do ƣợc tính bằng cơng thức % DPPH = [(A0 - (A-Ab))/A0] × 100 %
Trong đó A0 là mẫu kiểm chứng, A là mẫu thí nghiệm, Ab là mẫu trắng.
2.2.9. Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu đƣợc xử lý theo phƣơng pháp xác suất thống kê với phần mềm Excel (Microsoft office). Các thí nghiệm đƣợc lặp lại ít nhất 3 lần.
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Thu cao chiết từ các mẫu thực vật
Để tìm hiểu thành phần hóa học của các mẫu thực vật thu thập từ Lào chúng tôi tiến hành chiết từ 5g mẫu thực vật trong các dung mơi có độ phân cực tăng dần gồm n-Hexan, Ethyl acetate và Ethanol 80%. Các mẫu thực vật đƣợc hòa tan trong dung mơi sau đó thu hồi dung mơi ở nhiệt độ và áp suất phù hợp để thu đƣợc cao chiết khô. Kết quả khối lƣợng cao chiết các mẫu thực vật nghiên cứu thu đƣợc từ các dung môi đƣợc thể hiện ở bảng 3.1
Bảng 3.1. Hiệu suất chiết trong các dung môi khác nhau từ các mẫu thực vật
Tên mẫu Ký hiệu
Cao Ethanol 80 % Cao Ethyl acetate
Khối lƣợng cao (g) Tỷ lệ (%) khối lƣợng cao (g) Tỷ lệ (%) Sƣơng sâm 1 0,29 5,8 0,09 1,8 Tầm gửi 3 0,29 5,8 0,16 3,2 Sầu đâu 4 0,15 3 0,17 3,4 Croton 5 1,45 29 0,17 3,4 Trinh nữ 6 0,23 4,6 0 0 Cây nhầu 7 0,2 4 0,09 1,8 Muồng đen 8 0,14 2,8 0 0 Keo đậu 9 0,47 9,4 0,36 9,2 Núc nác 10 0,16 3,2 0,24 4,8
Kết quả đánh giá hiệu suất chiết từ các dung môi trong bảng 3.1 cho thấy với dung môi chiết n-Hexan các mẫu thực vật nghiên cứu hầu nhƣ không tan, khối lƣợng cao chiết rất thấp.
Các hợp chất tự nhiên trong các cây có nguồn gốc từ Lào đều có khả năng tan tốt trong Ethanol 80% và Ethyl acetate. Tỉ lệ khối lƣợng cao chiết với Ethanol 80% đạt từ 2,8% - 9,4%.
Tỉ lệ khối lƣợng cao chiết của các mẫu thực vật với dung môi Ethyl acetate từ 1,8% - 9,2%, trong đó tỉ lệ khối lƣợng cao chiết của cây Trinh nữ và Muồng đen
có tỉ lệ thấp nhất (hai mẫu này hầu nhƣ chiết đƣợc trong dung môi Ethyl acetate). Khối lƣợng cao thu đƣợc cao nhất ở Sầu đâu và Croton đạt tỷ lệ 3,4%.
Qua tỉ lệ % khối lƣợng các loại cao chiết trong các dung môi khác nhau, các mẫu chiết với khối lƣợng lớn bao gồm có: dung mơi Ethyl axetat: keo đậu (9,2%) sau đó tới Núc nác (4,8%), tiếp theo các mẫu Sầu đâu, Croton (>3%); dung môi Ethanol 80% với Croton (29%), Keo đậu (9,4%), Tầm gửi và Sƣơng sâm (>5%), các mẫu còn lại đều có tỉ lệ lớn (>3%).
3.2. Kết quả sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết và cao chiết các mẫu thực vật
3.2.1. Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết các mẫu trong n-Hexan
Phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch đƣợc sử dụng trong việc đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết n-Hexan của các mẫu thực vật, các mẫu dịch chiết thể hiện không rõ ràng khả năng kháng khuẩn. Để cô đặc lƣợng chất chiết và thể hiện rõ ràng khả năng kháng khuẩn của các mẫu vi khuẩn, tiến hành cô cạn dung môi, thu hồi cao chiết. Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của các cao chiết n-Hexan của các mẫu thực vật cho thấy cao chiết có khả năng ức chế sự phát triển của các vi sinh vật kiểm định định lƣợng bằng vòng kháng khuẩn.
Tuy nhiên, do khối lƣợng hòa tan các hợp chất thứ sinh của các mẫu thực vật trong dung môi n-Hexan thấp, nên khả năng kháng khuẩn của cao chiết thực vật trong n-Hexan là hạn chế. Trong các mẫu thử nghiệm, mẫu cao chiết n-Hexan cây Croton có khả năng ức chế hoạt động của 2/4 chủng vi khuẩn kiểm định là B. subtilis và B. cereus.
Hình 3.1. Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn các mẫu cao n-Hexan thực vật trên 2
chủng B. subtilis và B.cereus
Chú thích: Các giếng 5: dịch chiết croton; giếng 6: dịch chiết Trinh nữ; giếng 7 dịch chiết cây nhàu; giếng 8: dịch chiết muồng đen; (+): đối chứng dương; (n- hecxan); đối chứng âm n-Hexan.
3.2.2. Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết mẫu thực vật trong Ethanol 80%
Tiến hành thử hoạt tính kháng khuẩn của các dịch chiết thực vật trong Ethanol 80%, thu đƣợc trình bày trong bảng 3.2.
Bảng 3.2. Khả năng kháng khuẩn của các dịch chiết trong dung môi Ethanol 80% Tên mẫu Ký hiệu
mẫu
Khả năng kháng khuẩn
E. coli B. cereus B. subtilis S. aureus
Sƣơng sâm 1 - - × - Tầm gửi 3 - - - - Sầu đâu 4 - × × - Croton 5 - - - - Trinh nữ 6 - - - - Cây nhầu 7 - - - - Muồng đen 8 - × - - Keo đậu 9 - × - - Núc nác 10 × × × ×
Chú thích: ×: có xuất hiện vịng kháng khuẩn; - khơng tạo vòng kháng khuẩn
So với dịch chiết n-Hexan, các dịch chiết Ethanol của các mẫu thực vật cho kết quả tạo vịng kháng khuẩn nhiều hơn. Có 5 mẫu có khả năng tạo vịng kháng khuẩn với ít nhất 1 loại vi sinh vật kiểm định. Điều này đƣợc lý giải do các hợp chất thứ sinh có hoạt tính kháng khuẩn ở thực vật đƣợc hịa tan trong dung môi Ethanol 80% với nồng độ lớn. Kết quả đo vịng hoạt tính kháng khuẩn của các dịch chiết thực vật với Ethanol 80% phần lớn đều cho hoạt tính kháng khuẩn. Dịch chiết cây Núc nác thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất với cả 4 chủng vi khuẩn nghiên cứu trong khi dịch chiết từ Croton, trinh nữ, tầm gửi hay nhàu thì khơng có khả năng tạo vịng kháng khuẩn với các chủng kiểm định.
Thí nghiệm thử hoạt tính kháng vi khuẩn cùng với cao chiết cho kết quả hoạt tính kháng khuẩn sẽ thể hiện rõ hơn khi nồng độ các hợp chất thực vật kháng khuẩn lớn hơn. Tiến hành cô cạn dung môi Ethanol 80%, thu cao chiết. Cao chiết tiếp tục đƣợc thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn. Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Ethanol 80% đƣợc thể hiện trong bảng 3.3.
Bảng 3.3. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Ethanol 80%
Tên mẫu Ký hiệu mẫu
Khả năng kháng khuẩn (mm)
E. coli B. cereus B. subtilis S. aureus
Sƣơng sâm 1 0 0 6 0 Tầm gửi 3 6 0 0 3 Sầu đâu 4 10 8 9 8 Croton 5 3 4 1 6 Trinh nữ 6 2 0 0 6 Cây nhầu 7 0 1 7 2 Muồng đen 8 0 9 4 0 Keo đậu 9 1 7 0 6 Núc nác 10 12 10 5 5
Dịch chiết Ethanol 80% của các mẫu thực vật có khả năng kháng khuẩn tốt. Dịch chiết mỗi mẫu thực vật có khả năng kháng ít nhất 1/4 chủng vi sinh vật kiểm định. 6/9 loại dịch chiết thực vật có khả năng kháng lại chủng E. coli, 6/9 loại dịch chiết thực vật có khả năng kháng lại chủng B. cereus, 6/9 loại dịch chiết thực vật có