Mẫu nuôi cấy lấy từ chồi bên của cây ghép 4 tháng tuổi. Mẫu được lấy ở chồi 20 ngày tuổi, sinh trưởng tốt, không sâu bệnh. Chồi được cắt bỏ một phần cuống lá và toàn bộ phiến lá. Mẫu cấy có chiều dài từ 3-6cm mang từ 1-2 nách lá.
2.4.2. Địa điểm, điều kiện bố trí thí nghiệm
- Địa điểm nghiên cứu: Các thí nghiệm được tiến hành tại phịng ni cÊy m« cđa Trung tâm nghiên cứu giống c©y rõng – ViƯn khoa häc Lâm nghiệp, Đông Ngạc, Từ Liêm, Hà Nội.
Điều kiện thí nghiệm tuân theo tiêu chuẩn và quy định kỹ thuật của phịng ni cấy mơ:
+ Số giờ chiếu sáng trong ngµy lµ 10h/ngµy. + Cêng độ ánh sáng khoảng 2000-3000 Lux. + Nhiệt độ phịng ni 25 28OC.
+ Các dụng cụ sử dụng được hấp trong nồi tuyệt trùng có áp suất là 1.2- 1.5atm, nhiệt độ là 120-130OC.
+ PH cđa m«i trêng nu«i cÊy 5,6-5,8.
2.4.3. Phương pháp nghiên cứu
Cũng tương tự các loài cây Lâm nghiệp khác như Keo, Bạch đàn, Thơng …viƯc nh©n gièng in vitro cho TÕch cịng được tiến hành bằng phương pháp tạo cụm chồi với sơ đồ tổng quỏt sau:
Dòng tun chọn
Mẫu cấy
To chi ban u
Nhân chồi Tạo r Vn ươm
* Cấy khởi động:Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấyin vitro.
Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu: Tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và tái sinh tốt. Khử trùng mẫu bằng chất hố học có hoạt tính diệt nấm khuẩn được tiến hành qua các bước:
- Rửa xà phßng lo·ng. - Rưa díi vßi nước chảy. - Tráng nước cất.
- Ngâm trong dung dịch khử trùng khoảng 5-15 phút.
- Đổ bỏ dung dịch khử trùng, rửa lại bằng nước cất vô trùng từ 3-5 lần. - Cấy mẫu vào môi trường tái sinh chồi ban đầu, các thao tác được thực hiện trong buång cÊy v« trïng.
* Tạo và nhân nhanh chåi: lµ giai đoạn kích thích mơ cÊy ph¸t sinh
hình thành nhiều chồi. Vấn đề là phải xác định được môi trường và điều kiện ni cấy thích hợp để có hiệu quả cao nhất.
- Tái sinh chồi ban đầu từ mẫu nuôi cấy: Tiến hành cấy trên các mơi trêng kh¸c nhau nh WPM, MS, B5 có bổ sung 7g/l agar, 30g/l đường và độ pH của các mơi trường được ®iỊu chØnh ®Õn 5,8.
- Nh©n chồi: trên cơ sở của thí nghiệm tái sinh chồi ban đầu, tiếp tục thử nghiệm mơi trường tối ưu cho q trình nhân nhanh chồi bằng cách thay đổi thành phần chất khống và sự có mặt của các Cytokinin (BAP và Kinetin) riêng rẽ hay phối hợp.
* Tạo rễ và huấn luyện: là giai đoạn chuyển chồi từ môi trường nhân
nhanh sang mơi trường tạo rễ để có được cây con hồn chỉnh hoặc có thể cho ra rƠ trùc tiÕp trªn nền cát trong nhà kính. Chọn các chồi đủ tiêu chuÈn vÒ chiÒu cao, chÊt lượng nuôi cấy trên các môi trường tạo rễ hoặc cho ra rƠ trùc tiÕp, mơc đích là để tìm ra mơi trường thích hợp để tạo cây con hồn chỉnh. Sau đó cây con được huấn luyện để thích nghi với điều kiện bên ngoài.
*Đưa cây in vitro ra điều kiện bên ngồi: Để tìm giá thể thích hợp cho
cây con có tỷ lệ sống cao khi đưa ra ngồi điều kiện tự nhiên, tiến hành các thí nghiệm về thành phần ruột bầu.
2.4.4. Phương pháp bố trí thí nghiệm
Các mơi trường, loại hố chất và nồng độ chất điều hoà sinh trëng sư dơng trong nuôi cấy mô tế bào rất đa dạng và phong phó. Do ®ã, viƯc lùa chän loại mụi trng, loi v nng cỏc cht điu hoà sinh trëng cịng nh sù kÕt hợp giữa chúng với nhau được dựa trên kinh nghiệm và các kết quả nuôi cấy mơ một số lồi cây lâm nghiệp như Keo, Bạch đàn ....
Các thí nghiệm đều được bố trí theo dạng khối ngẫu nhiên đầy đủ với 3 lần lặp. Thí nghiệm 1-3 được tiến hành song song với 4 dòng cây trội Tếch ngẫu nhiên, quan sát trên 45 mẫu cấy. Thí nghiệm 4 8 quan sát trên 1 dòng cây trội Tếch với số mẫu quan sát là 50. Thí nghiệm 9-11 tiến hành với 10 dịng trội Tếch cã nguån gèc tõ Th¸i Lan, ViƯt Nam, Inđônêsia và Malaysia. Các mẫu thí nghiệm đều được kiểm tra hàng tuần để loại bỏ mẫu nhiễm và quan sát được diễn biến của mÉu cÊy.
ThÝ nghiƯm 1.¶nh hưởng của các loại hố chất ®Õn khư trïng mÉu
ThÝ nghiƯm được tiến hành với 3 loại hố chất là HgCl2nång ®é 0.05% vµ 0.1%, Ca(OCl)2vµ H2O2(Ơxi giµ) khư trïng trong thêi gian 5, 10 vµ 15 phút.
Do chưa xác định được mơi trường tối ưu cho giai đoạn cấy khởi động nên mẫu đà khử trùng được cấy vào môi trường MS cải tiến cã bæ sung 0.5mg/l BAP. Chỉ tiêu quan sát là số mẫu nhiễm, số mÉu bËt chåi vµ sè mÉu chết sau 30 ngày ni cấy.
Thí nghiệm 2. Xác định thời điểm lẫy mẫu thích hợp
Các thí nghiệm được tiến hành theo 4 mùa trong năm. - Thu: tháng 9-2006
- Đơng: tháng 12-2006 - Xn: tháng 3-2007
- H¹: tháng 6-2007
Chỉ tiêu quan sát lµ sè mÉu nhiƠm, sè mÉu bËt chåi vµ sè mẫu chết sau 30 ngày ni cÊy.
ThÝ nghiƯm 3. Xác định mơi trường tái sinh chồi ban đầu
Thí nghiệm được tiến hành trên ba loại mơi trường MS, WPM và B5 cã bỉ sung thªm mét sè chất khống và Vitamin (Mơi trường cải tiến)
Công thức 1: Môi trường MS* (Murashige và Skoog Medium). C«ng thøc 2: M«i trêng WPM* (McCown Woody Plant Medium). C«ng thøc 3: M«i trêng B5* (Micro-Macro Gamborg’s B5 medium). Chỉ tiêu quan sát là hệ số nhân chồi, chiều dài chồi và số lá/chồi.
ThÝ nghiƯm 4:¶nh hưởng của các Cytokinin (BAP và Kinetin) riêng rẽ
đến khả năng nhân nhanh và kéo dài chồi
Chất điều hoà
sinh trëng Cơng thức Thành phần mơi trường
§C MS* BAP K1 MS* + 0,1mg/l kinetin K2 MS* + 0,5mg/l kinetin K3 MS* + 1,0 mg/l kinetin K4 MS* + 1,5 mg/l kinetin Kinetin B1 MS* + 0,1 mg/l BAP B2 MS* + 0,5 mg/l BAP B3 MS* + 1,0 mg/l BAP B4 MS* + 1,5 mg/l BAP Chỉ tiêu quan sát là hệ số nhân chồi, chiều dài chồi và số lá/chồi.
ThÝ nghiÖm 5: ¶nh hưởng của tổ hợp BAP và NAA đến khả năng nhân
nhanh và kéo dài chồi
Chất điều hoà sinh
trëng Côngthc Thnh phn mụi trường
BAP NAA
Đối chứng ĐC MS*
0.3
0.1 BA1 MS*+0,3mg/l BAP +0,1mg/l NAA 0.5 BA2 MS*+0,3mg/l BAP +0,5mg/l NAA 1.0 BA3 MS*+0,3mg/l BAP +1,0mg/l NAA 1.5 BA4 MS*+0,3mg/l BAP +1,5mg/l NAA
0.5
0.1 BA5 MS*+0,5mg/l BAP +0,1mg/l NAA 0.5 BA6 MS*+0,5mg/l BAP +0,5mg/l NAA 1.0 BA7 MS*+0,5mg/l BAP +1,0mg/l NAA 1.5 BA8 MS*+0,5mg/l BAP +1,5mg/l NAA
0.7
0.1 BA9 MS*+0,7mg/l BAP +0,1mg/l NAA 0.5 BA10 MS*+0,7mg/l BAP +0,5mg/l NAA 1.0 BA11 MS*+0,7mg/l BAP +1,0mg/l NAA 1.5 BA12 MS*+0,7mg/l BAP +1,5mg/l NAA Chỉ tiêu quan sát là hệ số nhân chồi, chiều dài chồi và số lá/chồi.
ThÝ nghiƯm 6: ¶nh hëng của các Auxin (IBA và NAA) riêng rẽ đến
tû lƯ ra rƠ trong èng nghiƯm
Các chồi đủ tiêu chuẩn cao trên 2.0 cm cứng cáp khoẻ mạnh được cấy vào môi trường ra rễ là mơi trêng 1/2MS* bỉ sung mét sè chÊt kÝch thÝch sinh trưởng ở nồng độ khác nhau.
Hố chất Cơng thøc Nồng độ (mg/l) Thnh phn Đối chứng ĐC 0 MS*/2 IBA R1 0,5 MS*/2+ 0,5 mg/l IBA R2 1,0 MS*/2+ 1,0 mg/l IBA R3 1,5 MS*/2+ 1,5 mg/l IBA R4 2,0 MS*/2+ 2,0 mg/l IBA NAA R5 0,5 MS*/2+ 0,5 mg/l NAA R6 1,0 MS*/2+ 1,0mg/l NAA R7 1,5 MS*/2+ 1,5 mg/l NAA R8 2,0 MS*/2+ 2,0 mg/l NAA Chỉ tiêu quan sát là tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/chồi và chiều dài trung bình/rễ.
ThÝ nghiƯm 7:¶nh hưởng của IBA và NAA đến tỷ lệ ra rễ ở vườn ươm
Các chồi đủ tiêu chuẩn cao trên 2.0cm và cứng cáp khoẻ mạnh ®ỵc chÊm thc TTG cã gèc là các Auxin ở nồng độ khác nhau để kích thÝch ra rƠ, sau ®ã cÊy xuống nền cát hay bầu đất đà được khử trùng bằng thuốc tím và Benlat.
Hố chÊt C«ng thøc Nồng độ Đối chứng §C 0 IBA R9 0,5% IBA R10 1,0% IBA R11 1,5% IBA R12 2,0% IBA NAA R13 0,5%NAA R14 1,0%NAA R15 1,5%NAA R16 2,0%NAA
Chỉ tiêu quan sát là tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/chồi và chiều dài trung bình/rễ.
ThÝ nghiƯm 8:¶nh hưởng của nhân tố mùa vụ đến tỷ lệ ra rƠ
Tõ kÕt qu¶ ra rƠ ở vườn ươm tiến hành thí nghiệm với 3 lần lặp, mỗi lần lặp quan sát 45 chồi. Thí nghiệm tiến hành vào các mùa khác nhau trong năm.
Mùa Xuân: tháng 3/2007. Mùa Hạ: tháng 6/2007. Mïa Thu: th¸ng 9/2006. Mùa Đơng: tháng 12/2006.
Chỉ tiêu quan sát là tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bỡnh/chi v chiu di trung bình/r.
Thí nghim 9: So sánh kt quả vào mẫu của 10 dòng cây trội Tếch cã
nguån gèc kh¸c nhau
Thí nghiệm được tiến hành với 10 dịng Tếch của Việt Nam, Thái Lan, Indonesia vµ Malaysia (VN18, VN21, VN22, VN9, TL1,TL2, TL5, ID, MD1, MD4), khö trïng b»ng HgCl20.05% trong 10 phót.
ChØ tiªu quan sát là số mẫu nhiễm, số mẫu bật chồi vµ sè mÉu chÕt sau 30 ngày ni cấy.
Thí nghiệm 10: So sánh khả năng nhân chồi của 10 dịng cây trội TÕch
cã ngn gèc kh¸c nhau
Thí nghiệm được tiến hành với 10 dịng Tếch (như thí nghiệm 9). Mơi trường sử dụng trong thí nghiệm là mơi trêng MS* cã bỉ sung 0,7mg/l BAP vµ 0,5mg/l NAA.
ChØ tiêu quan sát là hệ số nhân chồi, chiều dài chồi và số lá/chồi.
Thí nghiệm 11: So sánh khả năng ra rễ của 10 dịng cây trội Tếch có
Thí nghiệm được tiến hành với 10 dịng Tếch như thí nghiệm 9 và 10. Các chồi đủ tiêu chuẩn cao hơn 3,0cm và cứng cáp khoẻ mạnh được chấm thuốc bột IBA 1,0% rồi cấy vào cát sạch đà được khư trïng b»ng Benlat.
ChØ tiªu quan sát là tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/chồi và chiều dài trung bình/rễ.
2.5. Phương pháp thống kê và sư lÝ sè liƯu
C¸c chØ tiêu theo dõi và thu thập
1, Tû lƯ mÉu nhiƠm (%) = Tỉng sè mÉu nhiƠm x 100 Tổng số mẫu ban đầu
2, Tû lƯ mÉu t¹o chåi (%) = Tỉng sè mÉu n¶y chåi x 100 Tỉng sè mÉu cÊy vào
3, Chiu cao trung bình (Cm) = Tng chiu cao chåi x 100 Tổng số mẫu ban đầu
4, Hệ số nhân (Lần) = Tổng số chồi mới hình thành x 100 Tổng số chồi ban đầu
5, Tû lƯ ra rƠ (%) = Tỉng sè chåi ra rƠ x 100 Tỉng sè chåi nu«i cÊy
6, Chiều dài rễ trung bình (cm) = Tỉng chiỊu dµi rƠ Tỉng sè rƠ
Số liệu thu được nghi chép trong bảng biểu và xử lý trên máy tính bằng phần mềm thống kê Excel và SPSS.
Một số cơng thức tính tốn nh sau: - Số trung bình mẫu: X = n 1 Xi n i 1 (3.1) - Phương sai: S2= 1 1 n Xi X n i ( 1 )2 (3.2)
Nếu nhân tố A tác động đồng đều lên kết quả thí nghiệm thì giả thuyết Ho đặt ra là: Ho: 1=2=…a=
Còn đối thuyÕt H1: Nhân tố A tác động khơng đồng đều ®Õn kÕt qu¶ thÝ nghiƯm. NghÜa là có ít nhất 1 số trung bình tổng thể i kh¸c víi c¸c sè trung bình tổng thể cịn lại.
Ngêi ta ®· chøng minh được rằng nếu giả thuyết Ho đúng thì biến ngẫu nhiên Vn có phân bố: 2 víi k= n-a bËc tự do và Va có phân bố 2 với k = a-1 bậc tự do vì vậy biến ngẫu nhiên:
(n-a)Va
FA = (3.3)
(a-1)Vn
Víi Valµ tổng biến động do nhân tố A và Vnlµ tỉng biến động ngẫu nhiên
Va= n x c a i i . 1 víi c = n x a i n j ij i 1 1 2 ) ( (3.4) Vn= a i i i a i n j ij n x x i . 1 1 1 2 (3.5)
Ph©n bè F víi k1=a-1 vµ k2= n-a bËc tù do.
NÕu FA tÝnh theo (1) F0.5 tra b¶ng víi k1=a-1 và k2 = n-a bậc tự do thì gi thuyt Ho đợc chấp nhận, ngược l¹i nÕu FAtÝnh theo (1)> F0.5thì giả thuyết Ho bị bác bỏ nghĩa là nhân tố A tác động khơng đồng đều tíi kÕt qu¶ thÝ nghiệm, nói cách khác việc phân cấp các cơng thøc thÝ nghiƯm lµ cã ý nghÜa.
Phương pháp phân tích phương sai trên dựa vào phần mỊm m¸y tÝnh SPSS11.5.
Kiểm tra thống kê ảnh hưởng của các nhân tố đến các chỉ tiêu nghiên cứu, dùng các thủ tục phân tích phương sai một nhân tố và phân tích phương sai hai nh©n tè víi møc ý nghÜa =0.05.
*Phân tích phương sai một nhân tố
Giả thiết Ho l1 = 2 = 3=..i=.=k trong đó i là trung bỡnh tổng thể thứ i mà từ đó mẫu thứ i được rút ra.
Trong phân tích phương sai thì kết quả được trình bày dưới dạng 1 bảng tính gọi là bảng phõn tớch phng sai:
Nguồn biến động (Source) Tổng biến động (SS) Bậc tự do (df) Phương sai (MS) F Xác suất ca F (sig) Nhân tố A VA a-1 S2 a= VA/a-1 S2 a/ S2 N
NgÉu nhiªn VN n-a S2
N= VN/n-a
Tỉng VT n-1 S2
T= VT/n-1
Trong bảng phân tích phương sai, giá trị thống kê F được tính với mức ý nghÜa (sig) 0.05 thì giả thuyết Ho bị bác bỏ nghĩa là các cơng thức thí nghiệm khác nhau có ảnh hưởng khác nhau đến kết quả thí nghiệm. Nếu giá trị thống kê F tính được với mức ý nghĩa (sig) > 0.05 thì giả thuyết Ho được chấp nhận nghĩa là các cơng thức thí nghiệm khác nhau đều không ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm.
Để so sánh nhiều cặp công thức với nhau, tìm ra cơng thức có ¶nh hëng tréi nhÊt ta dïng tiêu chuẩn Duncan. Các giá trị trung bình được phân thành các tập con, mỗi tập con chứa các số trung bình thuần nhất. Kết quả từ bảng cho thấy cơng thức cã ¶nh hëng tréi nhÊt.
* Phân tích phương sai hai nhân tố
Giả thuyết thường được cho là:
H0A: i = 0 với mọi i (và đối thuyết H1AÝt nhÊt cã mét i0) H0B: j = 0 với mọi j (và đối thuyết H1BÝt nhÊt có một j0)
Bng phõn tớch phng sai cú dạng: Nguồn biến động (Source) Tổng biến động (SS) Bậc tự do (df) Phương sai (MS) F Xác suất của F (sig) Nhân tố A VA a-1 S2a= VA/a-1 S2 a/S2 N Nh©n tè B VB b-1 S2 b= VB/b-1 S2 b/S2 N Ngẫu nhiên VN (a-1).(b-1) S2
N= VN/(a-1).(b-1) Toàn bộ VT n-1 S2T= VT/n-1
Trong bảng phân tích phương sai, giá trị thống kê F được tính với mức ý nghÜa (sig) 0.05 thì giả thuyÕt H0A bị bác bỏ nghĩa là nhân tố A có ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm; Nếu giá trị thống kê F tính được với mức ý nghĩa (sig) > 0.05 thì giả thuyÕt H0Ađược chấp nhận nghĩa là nhân tố A không ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm. Nhân tố B cũng tương tự như nhân tố A.
Để so sánh nhiều cặp cơng thức với nhau, tìm ra cơng thức có ảnh hëng tréi nhÊt ta dïng tiªu chuẩn Duncan. Các giá trị trung bình được phân thành các tập con, mỗi tập con chứa các số trung bình thuần nhất. Kết quả từ bảng cho thấy cơng thc cú ảnh hưởng trội nhất.
Chương 3
Kt qu nghiờn cu và thảo luận
3.1. Khư trïng mÉu vËt
3.1.1.¶nh hưởng của các loi hoỏ cht đến kh trùng mẫu vật
Môi trng ni cấy có chứa đường muối khống và các loại Vitamin Do vậy, các lồi nấm và vi khuẩn có điều kiện rất thuận lợi để phát triển. Nấm và vi khuẩn có tốc độ phân bào lớn hơn rất nhiều lần so với tế bào thực vật, nên nếu trong môi trường và mẫu ni cấy có bào tử nấm hoặc vi khuẩn th× chØ sau mét thời gian ngắn tồn bộ mơi trường và mẫu nuôi cÊy sÏ bÞ