2.4. 1 Vật liệu nuôi cấy
2.4.4. Phương pháp bố trí thí nghiệm
Các mơi trường, loại hố chất và nồng độ chất điều hoà sinh trưởng sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào rất đa dạng và phong phú. Do đó, việc lựa chọn loại môi trường, loại và nồng độ các chất điều hoà sinh trưởng cũng như sự kết hợp giữa chúng với nhau được dựa trên kinh nghiệm và các kết quả ni cấy mơ một số lồi cây lâm nghiệp như Keo, Bạch đàn ....
Các thí nghiệm đều được bố trí theo dạng khối ngẫu nhiên đầy đủ với 3 lần lặp. Thí nghiệm 1-3 được tiến hành song song với 4 dòng cây trội Tếch ngẫu nhiên, quan sát trên 45 mẫu cấy. Thí nghiệm 4 – 8 quan sát trên 1 dịng cây trội Tếch với số mẫu quan sát là 50. Thí nghiệm 9-11 tiến hành với 10 dịng trội Tếch có nguồn gốc từ Thái Lan, Việt Nam, Inđônêsia và Malaysia. Các mẫu thí nghiệm đều được kiểm tra hàng tuần để loại bỏ mẫu nhiễm và quan sát được diễn biến của mẫu cấy.
Thí nghiệm 1.ảnh hưởng của các loại hố chất đến khử trùng mẫu
Thí nghiệm được tiến hành với 3 loại hoá chất là HgCl2nồng độ 0.05% và 0.1%, Ca(OCl)2và H2O2(Ôxi già) khử trùng trong thời gian 5, 10 và 15 phút.
Do chưa xác định được môi trường tối ưu cho giai đoạn cấy khởi động nên mẫu đã khử trùng được cấy vào môi trường MS cải tiến có bổ sung 0.5mg/l BAP. Chỉ tiêu quan sát là số mẫu nhiễm, số mẫu bật chồi và số mẫu chết sau 30 ngày ni cấy.
Thí nghiệm 2. Xác định thời điểm lẫy mẫu thích hợp
Các thí nghiệm được tiến hành theo 4 mùa trong năm. - Thu: tháng 9-2006
- Đông: tháng 12-2006 - Xuân: tháng 3-2007
- Hạ: tháng 6-2007
Chỉ tiêu quan sát là số mẫu nhiễm, số mẫu bật chồi và số mẫu chết sau 30 ngày nuôi cấy.
Thí nghiệm 3. Xác định mơi trường tái sinh chồi ban đầu
Thí nghiệm được tiến hành trên ba loại mơi trường MS, WPM và B5 có bổ sung thêm một số chất khống và Vitamin (Mơi trường cải tiến)
Công thức 1: Môi trường MS* (Murashige và Skoog Medium). Công thức 2: Môi trường WPM* (McCown Woody Plant Medium). Công thức 3: Môi trường B5* (Micro-Macro Gamborg’s B5 medium). Chỉ tiêu quan sát là hệ số nhân chồi, chiều dài chồi và số lá/chồi.
Thí nghiệm 4:ảnh hưởng của các Cytokinin (BAP và Kinetin) riêng rẽ
đến khả năng nhân nhanh và kéo dài chồi
Chất điều hoà
sinh trưởng Công thức Thành phần môi trường
ĐC MS* BAP K1 MS* + 0,1mg/l kinetin K2 MS* + 0,5mg/l kinetin K3 MS* + 1,0 mg/l kinetin K4 MS* + 1,5 mg/l kinetin Kinetin B1 MS* + 0,1 mg/l BAP B2 MS* + 0,5 mg/l BAP B3 MS* + 1,0 mg/l BAP B4 MS* + 1,5 mg/l BAP Chỉ tiêu quan sát là hệ số nhân chồi, chiều dài chồi và số lá/chồi.
Thí nghiệm 5: ảnh hưởng của tổ hợp BAP và NAA đến khả năng nhân
nhanh và kéo dài chồi
Chất điều hoà sinh
trưởng Côngthức Thành phần môi trường
BAP NAA
Đối chứng ĐC MS*
0.3
0.1 BA1 MS*+0,3mg/l BAP +0,1mg/l NAA 0.5 BA2 MS*+0,3mg/l BAP +0,5mg/l NAA 1.0 BA3 MS*+0,3mg/l BAP +1,0mg/l NAA 1.5 BA4 MS*+0,3mg/l BAP +1,5mg/l NAA
0.5
0.1 BA5 MS*+0,5mg/l BAP +0,1mg/l NAA 0.5 BA6 MS*+0,5mg/l BAP +0,5mg/l NAA 1.0 BA7 MS*+0,5mg/l BAP +1,0mg/l NAA 1.5 BA8 MS*+0,5mg/l BAP +1,5mg/l NAA
0.7
0.1 BA9 MS*+0,7mg/l BAP +0,1mg/l NAA 0.5 BA10 MS*+0,7mg/l BAP +0,5mg/l NAA 1.0 BA11 MS*+0,7mg/l BAP +1,0mg/l NAA 1.5 BA12 MS*+0,7mg/l BAP +1,5mg/l NAA Chỉ tiêu quan sát là hệ số nhân chồi, chiều dài chồi và số lá/chồi.
Thí nghiệm 6: ảnh hưởng của các Auxin (IBA và NAA) riêng rẽ đến
tỷ lệ ra rễ trong ống nghiệm
Các chồi đủ tiêu chuẩn cao trên 2.0 cm cứng cáp khoẻ mạnh được cấy vào môi trường ra rễ là môi trường 1/2MS* bổ sung một số chất kích thích sinh trưởng ở nồng độ khác nhau.
Hố chất Cơng thức Nồng độ (mg/l) Thành phần Đối chứng ĐC 0 MS*/2 IBA R1 0,5 MS*/2+ 0,5 mg/l IBA R2 1,0 MS*/2+ 1,0 mg/l IBA R3 1,5 MS*/2+ 1,5 mg/l IBA R4 2,0 MS*/2+ 2,0 mg/l IBA NAA R5 0,5 MS*/2+ 0,5 mg/l NAA R6 1,0 MS*/2+ 1,0mg/l NAA R7 1,5 MS*/2+ 1,5 mg/l NAA R8 2,0 MS*/2+ 2,0 mg/l NAA Chỉ tiêu quan sát là tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/chồi và chiều dài trung bình/rễ.
Thí nghiệm 7:ảnh hưởng của IBA và NAA đến tỷ lệ ra rễ ở vườn ươm
Các chồi đủ tiêu chuẩn cao trên 2.0cm và cứng cáp khoẻ mạnh được chấm thuốc TTG có gốc là các Auxin ở nồng độ khác nhau để kích thích ra rễ, sau đó cấy xuống nền cát hay bầu đất đã được khử trùng bằng thuốc tím và Benlat.
Hố chất Cơng thức Nồng độ Đối chứng ĐC 0 IBA R9 0,5% IBA R10 1,0% IBA R11 1,5% IBA R12 2,0% IBA NAA R13 0,5%NAA R14 1,0%NAA R15 1,5%NAA R16 2,0%NAA
Chỉ tiêu quan sát là tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/chồi và chiều dài trung bình/rễ.
Thí nghiệm 8:ảnh hưởng của nhân tố mùa vụ đến tỷ lệ ra rễ
Từ kết quả ra rễ ở vườn ươm tiến hành thí nghiệm với 3 lần lặp, mỗi lần lặp quan sát 45 chồi. Thí nghiệm tiến hành vào các mùa khác nhau trong năm.
Mùa Xuân: tháng 3/2007. Mùa Hạ: tháng 6/2007. Mùa Thu: tháng 9/2006. Mùa Đông: tháng 12/2006.
Chỉ tiêu quan sát là tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/chồi và chiều dài trung bình/rễ.
Thí nghiệm 9: So sánh kết quả vào mẫu của 10 dòng cây trội Tếch có
nguồn gốc khác nhau
Thí nghiệm được tiến hành với 10 dòng Tếch của Việt Nam, Thái Lan, Indonesia và Malaysia (VN18, VN21, VN22, VN9, TL1,TL2, TL5, ID, MD1, MD4), khử trùng bằng HgCl20.05% trong 10 phút.
Chỉ tiêu quan sát là số mẫu nhiễm, số mẫu bật chồi và số mẫu chết sau 30 ngày ni cấy.
Thí nghiệm 10: So sánh khả năng nhân chồi của 10 dịng cây trội Tếch
có nguồn gốc khác nhau
Thí nghiệm được tiến hành với 10 dịng Tếch (như thí nghiệm 9). Mơi trường sử dụng trong thí nghiệm là mơi trường MS* có bổ sung 0,7mg/l BAP và 0,5mg/l NAA.
Chỉ tiêu quan sát là hệ số nhân chồi, chiều dài chồi và số lá/chồi.
Thí nghiệm 11: So sánh khả năng ra rễ của 10 dịng cây trội Tếch có
Thí nghiệm được tiến hành với 10 dịng Tếch như thí nghiệm 9 và 10. Các chồi đủ tiêu chuẩn cao hơn 3,0cm và cứng cáp khoẻ mạnh được chấm thuốc bột IBA 1,0% rồi cấy vào cát sạch đã được khử trùng bằng Benlat.
Chỉ tiêu quan sát là tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/chồi và chiều dài trung bình/rễ.