2.4. 1 Vật liệu nuôi cấy
2.4.2. Địa điểm, điều kiện bố trí thí nghiệm
- Địa điểm nghiên cứu: Các thí nghiệm được tiến hành tại phịng ni cấy mô của Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng – Viện khoa học Lâm nghiệp, Đơng Ngạc, Từ Liêm, Hà Nội.
Điều kiện thí nghiệm tuân theo tiêu chuẩn và quy định kỹ thuật của phịng ni cấy mô:
+ Số giờ chiếu sáng trong ngày là 10h/ngày. + Cường độ ánh sáng khoảng 2000-3000 Lux. + Nhiệt độ phịng ni 25 – 28OC.
+ Các dụng cụ sử dụng được hấp trong nồi tuyệt trùng có áp suất là 1.2- 1.5atm, nhiệt độ là 120-130OC.
+ PH của môi trường nuôi cấy 5,6-5,8.
2.4.3. Phương pháp nghiên cứu
Cũng tương tự các loài cây Lâm nghiệp khác như Keo, Bạch đàn, Thông …việc nhân giống in vitro cho Tếch cũng được tiến hành bằng phương pháp tạo cụm chồi với sơ đồ tổng quát sau:
Dòng tuyển chọn
Mẫu cấy
Tạo chồi ban đầu
Nhân chồi Tạo rễ Vườn ươm
* Cấy khởi động:Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấyin vitro.
Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu: Tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và tái sinh tốt. Khử trùng mẫu bằng chất hố học có hoạt tính diệt nấm khuẩn được tiến hành qua các bước:
- Rửa xà phịng lỗng. - Rửa dưới vịi nước chảy. - Tráng nước cất.
- Ngâm trong dung dịch khử trùng khoảng 5-15 phút.
- Đổ bỏ dung dịch khử trùng, rửa lại bằng nước cất vô trùng từ 3-5 lần. - Cấy mẫu vào môi trường tái sinh chồi ban đầu, các thao tác được thực hiện trong buồng cấy vô trùng.
* Tạo và nhân nhanh chồi: là giai đoạn kích thích mơ cấy phát sinh
hình thành nhiều chồi. Vấn đề là phải xác định được mơi trường và điều kiện ni cấy thích hợp để có hiệu quả cao nhất.
- Tái sinh chồi ban đầu từ mẫu nuôi cấy: Tiến hành cấy trên các môi trường khác nhau như WPM, MS, B5 có bổ sung 7g/l agar, 30g/l đường và độ pH của các môi trường được điều chỉnh đến 5,8.
- Nhân chồi: trên cơ sở của thí nghiệm tái sinh chồi ban đầu, tiếp tục thử nghiệm mơi trường tối ưu cho q trình nhân nhanh chồi bằng cách thay đổi thành phần chất khống và sự có mặt của các Cytokinin (BAP và Kinetin) riêng rẽ hay phối hợp.
* Tạo rễ và huấn luyện: là giai đoạn chuyển chồi từ môi trường nhân
nhanh sang mơi trường tạo rễ để có được cây con hồn chỉnh hoặc có thể cho ra rễ trực tiếp trên nền cát trong nhà kính. Chọn các chồi đủ tiêu chuẩn về chiều cao, chất lượng nuôi cấy trên các môi trường tạo rễ hoặc cho ra rễ trực tiếp, mục đích là để tìm ra mơi trường thích hợp để tạo cây con hồn chỉnh. Sau đó cây con được huấn luyện để thích nghi với điều kiện bên ngồi.
*Đưa cây in vitro ra điều kiện bên ngồi: Để tìm giá thể thích hợp cho
cây con có tỷ lệ sống cao khi đưa ra ngoài điều kiện tự nhiên, tiến hành các thí nghiệm về thành phần ruột bầu.