3.1.1.ảnh hưởng của các loại hoá chất đến khử trùng mẫu vật
Mơi trường ni cấy có chứa đường muối khống và các loại Vitamin … Do vậy, các lồi nấm và vi khuẩn có điều kiện rất thuận lợi để phát triển. Nấm và vi khuẩn có tốc độ phân bào lớn hơn rất nhiều lần so với tế bào thực vật, nên nếu trong mơi trường và mẫu ni cấy có bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì chỉ sau một thời gian ngắn toàn bộ môi trường và mẫu nuôi cấy sẽ bị nhiễm nấm và vi khuẩn. Khi đó, thí nghiệm sẽ phải huỷ bỏ vì trong điều kiện này mô nuôi cấy sẽ không phát triển được và chết dần. Chính vì thế mà yếu tố vơ trùng trong thí nghiệm ni cấy mơ tế bào địi hỏi rất nghiêm ngặt.
Tạo được mẫu sạch là yếu tố hàng đầu của sự thành bại trong quá trình nhân giốngin vitro. Công việc tạo mẫu vô trùng là tương đối khó khăn vì khơng
những cần thao tác nhanh, khéo léo, cẩn thận mà còn phải loại bỏ một cách tuyệt đối các vi sinh vật có hại (nấm và vi khuẩn) bằng các hoá chất trong khi vẫn đảm bảo được sức sống cho mẫu cấy. Vấn đề chọn loại hoá chất, nồng độ sử dụng và thời gian khử trùng là một việc khó, cần có nhiều nghiên cứu để tìm ra cơng thức tốt nhất cho từng lồi cây. Xuất phát từ yêu cầu đó đề tài tiến hành nghiên cứu kỹ thuật khử trùng cho một số dịng Tếch nhằm tìm ra phương pháp khử trùng tốt nhất.
Theo tài liệu nghiên cứu của Street(1974) thì có thể sử dụng nhiều loại hoá chất để diệt nấm [43] nhưng do hạn chế về thời gian nên đề tài chỉ tiến hành thí nghiệm được với một số loại hoá chất là HgCl2 0.05% và 0.1%, CaCO3, H2O2. Đây là các hố chất có hoạt tính diệt nấm, khuẩn cao thường được sử dụng trong nghiên cứu nuôi cấy mô. Mẫu vật đã khử trùng được cấy vào mơi trường MS* có bổ sung 0,5mg/l BAP, quan sát số mẫu
nhiễm, mẫu bật chồi trong 30 ngày. Số liệu thu thập được tổng hợp và tính tốn trong phụ biểu 02, thể hiện trong bảng 3.1.
Bảng 3.1.ảnh hưởng của các loại hoá chất và thời gian khử trùng đến kết
quả vào mẫu
Hoá chất Thờigian Tổng số mẫu Tỷ lệ mẫu nhiễm Tỷ lệ mẫu sạch
TL mẫu chết TL mẫu bật chồi
HgCl2 0.1% 5 135 59,44 38,15 2,41 10 135 53,89 44,81 1,29 15 135 45,74 54,26 0 HgCl2 0.05% 5 135 84,63 11,85 3,52 10 135 75,00 11,30 13,70 15 135 66,30 28,70 4,99 Ca(ClO)2 5 135 100,00 0 0 10 135 88,52 9,26 2,22 15 135 81,85 15,74 2,41 H2O2 5 135 100,00 0 0 10 135 93,15 6,85 0 15 135 92,41 7,59 0
Do cấu trúc hình thái cành non của Tếch vng cạnh, phủ dày lơng hình sao nên khử trùng mẫu rất khó, tỷ lệ nhiễm thường rất cao (trên 45,74%) và tỷ lệ bật chồi thấp (dưới 13,70%).
Số liệu ở bảng 3.1 cho thấy các loại hoá chất, nồng độ và thời gian khử trùng có ảnh hưởng lớn đến tỷ lệ nhiễm, tỷ lệ bật chồi của mẫu cấy. Cùng một loại hoá chất nhưng nồng độ khác nhau cho kết quả khử trùng không giống nhau. Cùng một loại hoá chất, cùng một nồng độ nhưng thời gian khử trùng khác nhau cũng cho kết quả khác nhau tương đối rõ rệt. Mẫu khử trùng bằng Ca(ClO)2 và Ơxi già có tỷ lệ nhiễm rất cao (81,85% - 100%) nên khơng thích hợp cho khử trùng mẫu Tếch.
Kết quả phân tích ANOVA ở phụ biểu 02 cho thấy xác suất F tính được của hoá chất và thời gian khử trùng đều nhỏ hơn 0,05 điều đó chứng tỏ các cơng thức xử lý hố chất và thời gian khác nhau có ảnh hưởng rõ rệt đến tỷ lệ nhiễm của mẫu cấy. Qua tiêu chuẩn Duncan cho thấy cơng thức hố chất HgCl20,1%và thời gian xử lý mẫu trong vòng 15 phút cho tỷ lệ mẫu nhiễm thấp nhất là 45,74%. Tương tự với tỷ lệ mẫu bật chồi xác suất F tính được đều nhỏ hơn 0.05 (phụ biểu 02) nên các cơng thức hố chất và thời gian khác nhau cũng như tương tác qua lại giữa chúng có ảnh hưởng rõ rệt đến tỷ lệ mẫu bật chồi. Qua tiêu chuẩn của Duncan cho thấy cơng thức hố chất HgCl2 0,05% và thời gian khử trùng trong 10 phút cho tỷ lệ bật chồi cao nhất là 13,0%.
Tỷ lệ mẫu chết khi khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong bất kỳ thời gian nào đều cao hơn hẳn so với các cơng thức cịn lại (38,14% - 54.23%). Tiếp đến là công thức khử trùng bằng HgCl2 0.05% trong 15 phút (28,70%), các cơng thức cịn lại tỷ lệ mẫu chết đều thấp hơn 15,74%.
Kết quả trên có thể giải thích do HgCl2 vốn có độc tính mạnh nên có khả năng tiêu diệt nấm khuẩn, nhưng nếu nồng độ cao và thời gian xử lý q lâu thì nó thấm sâu vào tế bào chất phá huỷ chất nguyên sinh làm mẫu cấy hoá nâu thâm đen rồi chết.
Như vậy, đối với Tếch thì cơng thức khử trùng tốt nhất là HgCl2 0.05% trong khoảng thời gian 10 phút, tuy tỷ lệ nhiễm là 75,00% nhưng tỷ lệ mẫu bật chồi lại cao nhất (13,70%) so với các cơng thức thí nghiệm khác.
ảnh 1: Chồi Tếch sau khi vào mẫu được 30 ngày
3.1.2.ảnh hưởng của mùa vụ đến khả năng tái sinh chồi bất định ban đầu.
Kết quả nghiên cứu của một số tác giả cho Keo, Bạch đàn, Thông, Hông … cho thấy thời vụ và thời điểm lấy mẫu có ảnh hưởng đến tỷ lệ nhiễm và tỷ lệ bật chồi của mẫu cấy. Nghiên cứu của Đoàn Thị Mai và cộng sự cho thấy thời vụ vào mẫu của Bạch đàn lai U29C3 là từ tháng 5 đến tháng 8 [10]. Phạm Thị Kim Thanh tìm được mùa vụ vào mẫu của Thơng là từ tháng 4 đến tháng 10 [20]. Nghiên cứu của Anja Hohtoia cho thấy khả năng sống và mức độ nhiễm nấm bệnh của mẫu vật nuôi cấy bị ảnh hưởng theo mùa, mẫu nuôi cấy phát triển tốt vào mùa sinh trưởng Xuân Hè và phát triển kém vào mùa Thu Đông [27]…
Tếch là một loài cây sinh trưởng theo mùa nên nhân tố mùa vụ lấy mẫu có ảnh hưởng đến khả năng tái sinh chồi của mẫu vật. Để tìm hiểu ảnh hưởng của nhân tố mùa vụ cũng như trạng thái sinh lý trong mơ, cơ quan có liên
quan đến khả năng tái sinh chồi và sự nhiễm nấm bệnh trong ni cấy in vitro
lồi Tếch. Chính vì vậy đề tài tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của mùa vụ đến khả năng tái sinh chồi Tếch. Thí nghiệm được tiến hành nhằm xác định thời gian thích hợp cho việc đưa mẫu cấy vào môi trường vô trùng thành cơng nhất. Vật liệu thí nghiệm được lấy ở chồi 20 ngày tuổi, sinh trưởng tốt, không sâu bệnh của cây ghép 4 tháng tuổi. Mẫu cấy có chiều dài từ 3-6cm mang từ 1-2 nách lá, được khử trùng bằng HgCl2 0,05% trong khoảng thời gian 10 phút, sau đó cấy vào mơi trường MS có bổ sung 3% đường saccarose, 7% agar và 0,5mg/l BAP. Qua theo dõi diễn biến của mẫu trong 30 ngày để loại bỏ mẫu nhiễm và quan sát các mẫu bật chồi. Kết quả thu được ở phụ biểu 03, tổng hợp trong bảng 3.2 và thể hiện trên hình 3.1 như sau:
Bảng 3.2: ảnh hưởng của mùa vụ đến khả năng tái sinh chồi ban đầu
Mùa TL Mẫu nhiễm(%) TL mẫu bật chồi(%) TL mẫu chết(%)
Thu (9-2006) 64,07 6,67 29,26 Đông (12-2006) 59,81 3,33 36,85 Xuân (3-2007) 75,37 15,00 9,63 Hạ (6-2007) 73,52 13,89 12,59 F 26,77 47,51 70,56 SigF 0,000 0,000 0,000
75.37 5.99 18.64 73.52 5.44 21.05 64.07 2.68 33.25 59.82 0.97 39.22 0 10 20 30 40 50 60 70 80 TL %
Xuan Ha Thu Dong Mùa
TL Nhiem TL Bat choi TL Chet
Hình 3.1: Biểu đồ ảnh hưởng của mùa vụ đến khả năng tái sinh chồi ban đầu
Kết quả cho thấy nhân tố mùa vụ có ảnh hưởng rõ rệt đến tỷ lệ nhiễm và tỷ lệ bật chồi của mẫu cấy. Tỷ lệ mẫu bật chồi vào vụ Xuân Hè (15% và 13,89%) cao hơn so với vụ Thu Đơng (6,67% và 3,33%)
Kết quả phân tích ANOVA ở phụ biểu 03 cho thấy xác suất F (47,51) tính được của mùa vụ và tỷ lệ mẫu bật chồi là Sig=0,000 <0,05. Như vậy, tỷ lệ mẫu bật chồi của Tếch phụ thuộc vào thời điểm lấy mẫu khác nhau trong năm. Theo tiêu chuẩn Duncan cho thấy vào mùa xuân tỷ lệ mẫu bật chồi là cao nhất đạt 15,00% tiếp theo là mùa hè tỷ lệ bật chồi đạt 13,89% còn thấp nhất là vào mùa đơng chỉ đạt được 3,33% cịn mùa thu số mẫu bật chồi cũng không đáng kể 6,67%.
Tỷ lệ mẫu nhiễm và mẫu chết đều phụ thuộc vào mùa lấy mẫu do F tính được đều có mức ý nghĩa nhỏ hơn 0.05 rất nhiều. Tỷ lệ mẫu nhiễm cao nhất vào mùa Xuân (75,37%) tiếp theo là mùa Hè (73,52%), mùa Thu và mùa Đông tỷ lệ nhiễm lần lượt là 64,08% và 59,81%. Tỷ lệ mẫu chết thấp
nhất vào mùa Xuân (9,63%) và tăng dần theo mùa Hạ (12,59%), mùa Thu (29,26%) và mùa Đơng (36,85%).
Kết quả này có thể giải thích là do điều kiện khí hậu Việt Nam có tính chất biến đổi theo chu kỳ mùa trong năm đã dẫn đến những biến đổi về sinh lý, sinh hố trong q trình sinh trưởng và phát triển của thực vật nhằm thích hợp với điều kiện khí hậu. Hơn nữa Tếch là một loài cây sinh trưởng theo mùa, chúng sinh trưởng nhanh vào mùa xuân và mùa hạ còn về mùa thu và mùa đông Tếch sinh trưởng chậm lại và có hiện tượng rụng lá.
Một nguyên nhân nữa dẫn tới sự khác nhau này là do khí hậu (nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng…) trong khoảng thời gian lấy mẫu đã ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của cây. Các yếu tố khí hậu này sai khác nhau rõ rệt trong bốn thời điểm lấy mẫu dẫn đến sự sai khác trong kết quả thí nghiệm ở các thời gian khác nhau. Đợt lấy mẫu vào mùa Xuân và mùa Hè, cây đang trong mùa sinh trưởng, quá trình trao đổi chất mạnh mẽ, hormone nội sinh điều hồ nên có thể cho tỷ lệ mẫu bật chồi cao. Tuy nhiên, mùa Xuân và mùa Hè cũng là mùa thuận lợi cho sự phát triển của nấm khuẩn nên mẫu đưa vào mơi trường ni cấy có tỷ lệ nhiễm nấm khuẩn khá cao (73,52% - 75,37%). Đợt lấy mẫu vào mùa thu và mùa Đông nhiệt độ và độ ẩm khơng khí thấp, nấm bệnh khơng có điều kiện phát triển nên dễ khử trùng mẫu, tỷ lệ nhiễm nấm khuẩn thấp hơn. Nhưng tỷ lệ mẫu chết vào mùa Thu và mùa Đông lại cao hơn nữa tỷ lệ mẫu bật chồi thấp. Mặc dù tỷ lệ nhiễm của mẫu vật vào vụ Xuân Hè (75,37% và 73,52%) cao hơn so với vụ Thu Đông (64,07% và59,81%) nhưng tỷ lệ mẫu bật chồi (15,00% và 13,89%) lại cao hơn gấp 2-4 lần so với vị Thu Đông (6,67% và 3,33%). Từ đó, đề tài đưa ra kết luận thời điểm lấy mẫu thích hợp của Tếch là vào vụ Xuân Hè từ tháng 2 đến tháng 7.
Kết quả thí nghiệm chúng tơi thu được ở trên phù hợp với những nghiên cứu trước đây về mùa vụ vào mẫu. Những nghiên cứu trước đây đều cho thấy khả năng sống và mức độ nhiễm nấm bệnh của mẫu nuôi cấy bị ảnh hưởng
theo mùa, mẫu cấy phát triển tốt vào mùa sinh trưởng mùa Xuân Hè và phát triển kém hơn vào mùa Thu Đông.
3.2. ảnh hưởng của mơi trường và các chất điều hồ sinh trưởng đến nhân chồi Tếch
3.2.1. Xác định mơi trường ni cấy thích hợp
Trong nhân giống in vitro, mơi trường nuôi cấy là nguồn cung cấp các
chất dinh dưỡng cần thiết cho cây trong cả quá trình. Do các mẫu vật khi bị tách rời khỏi cây mẹ khơng cịn khả năng tự dưỡng, nếu không tiếp tục cung cấp chất dinh dưỡng thì chúng sẽ chết. Để tồn tại, tiếp tục phân hoá và phát triển trong điều kiện in vitro, chúng cần phải được cung cấp đầy đủ các chất
dinh dưỡng cần thiết cho sự sống của mô tế bào thực vật.
Khả năng tái sinh và phát triển của chồi trong quá trình ni cấy in vitrolà nhân tố quan trọng quyết định đến sự thành bại và tốc độ của việc ứng dụng quy trình nhân giống in vitro cho một đối tượng. Tuy nhiên, khả năng này không những phụ thuộc từng lồi, từng dịng và giai đoạn tuổi của từng đối tượng cụ thể mà cịn phụ thuộc vào mơi trường ni cấy. Chính vì thế, đề tài đã tiến hành thí nghiệm để tìm ra mơi trường tái sinh chồi phù hợp nhất cho loài Tếch.
Hệ số nhân chồi của Tếch phụ thuộc rất nhiều vào môi trường nuôi cấy bao gồm hàm lượng khống, các Vitamin và các chất điều hồ sinh trưởng… các nghiên cứu giai đoạn này nhằm tìm ra mơi trường thích hợp nhất cho q trình nhân chồi. Việc xác định mơi trường nuôi cấy cho một đối tượng được dựa trên cơ sở xem xét về nhu cầu dinh dưỡng cho từng nhóm lồi cây nhất định. Tếch thuộc nhóm lồi cây gỗ phát triển nhanh nên đề tài đã tiến hành chọn thử nghiệm 3 môi trường thường dùng trong nhân giống đó là mơi trường MS, WPM và mơi trường B5. Các mơi trường này có sự khác nhau về thành phần và hàm lượng các chất dinh dưỡng khoáng đa lượng, vi lượng và vitamin (phụ lục 01). Trên cơ sở quan sát hệ số nhân chồi, chiều dài chồi và số lá của
mẫu cấy ban đầu để so sánh đánh giá để tìm ra mơi trường thích hợp cho cây Tếch. Kết quả được tổng hợp ở phụ biểu 04 và bảng 3.3.
Bảng 3.3: ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng tái sinh chồi
Tếch (sau 4 tuần).
Môi trường Hệ số nhân (lần) Chiều dài chồi (cm) Số lá/chồi
MS 1,73 5,09 6,33 WPM 2,10 4,45 5,75 B5 1,56 3,51 4,75 F 17,039 68,095 7,656 SigF 0,000 0,000 0,002 1.732.101.56 5.09 4.45 3.51 6.33 5.75 4.75 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00
He so nhan Chieu dai choi So la
Chỉ tiêu
MS WPM B5
Hình 3.2: Biểu đồ ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng tái sinh chồi của Tếch
Kết quả cho thấy việc sử dụng các môi trường khác nhau có ảnh hưởng đến hệ số nhân, chiều dài chồi và số lá của các chồi Tếch trong ống nghiệm. Kết quả phân tích phương sai cho thấy sự sai khác về các chỉ tiêu này là hết
sức rõ rệt, xác suất F tính của hệ số nhân chồi, chiều cao chồi cũng như số lá/chồi đều nhỏ hơn 0,05.
Trong 3 loại môi trường, khi so sánh các chỉ tiêu hệ số nhân chồi, chiều dài chồi và số lá/chồi mơi trường B5 đều kém hơn rõ rệt. Do đó, khơng nên sử dụng môi trường B5 để ni cấy mơ Tếch vì chồi ni cấy cho hệ số nhân thấp, chồi ngắn còi cọc và nhiều lá giả.
Trong hai loại mơi trường cịn lại thì mơi trường WPM có hệ số nhân (2,10 lần) cao hơn so với mơi trường MS (1,73 lần), song chiều dài chồi và số lá của môi trường MS lại cao hơn. Hơn nữa, thực tế quan sát thì trong mơi trường MS các chồi bật khoẻ và mập hơn so với cấy trong môi trường WPM.
Từ kết quả quan sát và so sánh như trên đề tài kết luận môi trường MS cho hệ số nhân chồi cao và chất lượng chồi tốt (chồi khoẻ đẹp, lá xanh tốt). Môi trường WPM tuy cho hệ số nhân chồi cao hơn nhưng chồi gầy yếu, có biểu hiện mọng nước, lá và thân có màu xanh nhạt. Kết quả thu được ở trên chúng tơi có thể giải thích rằng sự thay đổi hàm lượng khống chủ yếu là các chất đa lượng và vi lượng như Nitơ, Phốtpho, Kali, Mangan, Magie…đã ảnh hưởng đến quá trình hình thành và phát triển của chồi Tếch in vitro. Mơi
trường MS và WPM có thành phần chất đa lượng, Vitamin và chất hữu cơ giống nhau song liều lượng lại khác nhau. Lượng đạm (N) trong môi trường WPM chỉ bằng 1/4 so với môi trường MS. Trong ba loại môi trường thử nghiệm thì mơi trường MS có đầy đủ các chất dinh dưỡng có thể cung cấp cho mẫu cấy ban đầu giống như ở cây mẹ nên chúng có khả năng bật chồi và phát triển tốt. Môi trường WPM có hệ số nhân chồi cao nhưng chất lượng chồi kém, có thể tiến hành nghiên cứu cải tiến hàm lượng dinh dưỡng khoáng và vitamin để nâng cao chất lượng chồi.
Như vậy, mơi trường MS là mơi trường thích hợp để ni cấy in vitro