1.2.4.2 .Phương pháp sinh học
1.3. Cơ sở khoa học của chuyển gen ở thực vật
1.3.2.3. Các hệ thống vector chuyển gen thực vật
Ti-plasmid tự nhiên khó được dùng trực tiếp trong các thí nghiệm chuyển gen vì có kích thước lớn (>200 kb) và mang các gen gây khối u bất lợi cho thực vật. Hơn nữa, trên trình tự DNA của Ti-plasmid có rất nhiều điểm cắt của enzyme giới hạn, điều đó gây ra những trở ngại trong q trình tạo vector tái tổ hợp mang gen mục tiêu để chuyển vào tế bào thực vật. Mặt khác, khi chuyển Ti-plasmid vào vi khuẩn E. coli chúng khơng có khả năng tự tái bản. Tuy nhiên, bên cạnh đó Ti- plasmid có thể cung cấp những yếu tố cần thiết quan trọng cho kĩ thuật chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium. Do đó, cần thiết kế lại để có thể sử dụng Ti-
plasmid trong kĩ thuật chuyển nạp gen vào thực vật. Cấu trúc chung của một vector chuyển gen vào tế bào thực vật bao gồm:
(1). Đoạn DNA khởi động (promoter). Đây là một đoạn DNA có liên quan và cần thiết cho sự khởi đầu phiên mã. Nó thường có một vị trí bám cho enzyme RNA polymeraza, một điểm khởi đầu phiên mã, và một số vị trí bám khác của các protein điều khiển và điều hịa q trình phiên mã. Các promoter hiện nay được sử dụng rộng rãi trong chuyển gen thực vật như: CaMV 35S promoter, NOS promoter.
(2). Đoạn DNA kết thúc (teminator). Đây là đoạn DNA cần thiết cho sự kết thúc của quá trình phiên mã và giải phóng phân tử mRNA khỏi sợi khn DNA. Đoạn này thường chứa các trình tự đặc trưng riêng ở vùng 3’ bao gồm các trình tự cho phép RNA polymerase nhận biết dấu hiệu ngừng phiên mã, và các trình tự kết thúc một gen.
(3). Điểm tái bản (replication) giúp vector có thể tái bản độc lập trong tế bào vi khuẩn.
(4). Vùng MCS (multi-cloning sites): Một đoạn DNA chứa các trật tự nucleotide đặc trưng cho sự nhận biết của các enzyme giới hạn. Nhờ đoạn DNA này người ta có thể dùng các enzyme giới hạn đặc hiệu để cắt plasmid tại điểm đặc thù và dùng DNA ligase để gắn đoạn gen mong muốn vào vector.
(5). Các gen chọn lọc (selectable marker genes) và gen chỉ thị (reporter genes). Các gen chọn lọc thường tổng hợp nên các enzyme giúp cho tế bào được biến nạp gen có khả năng sống được trên môi trường chứa các chất chọn lọc (kháng sinh, PPT, …). Các gen chỉ thị giúp cho nhận biết dễ dàng tế bào, mô và cây chuyển gen. Gen chọn lọc được sử dụng phổ biến là gen nptII, gen bar và gen chỉ thị là gen uidA.
Có hai hệ thống vector được sử dụng trong chuyển gen thông qua vi khuẩn
A. tumefaciens là vector liên hợp và vector nhị thể.
Hệ thống vector đồng liên hợp là kết quả của sự liên hợp hai loại vector. Vector thứ nhất được cải tiến từ Ti-plasmid với vùng gen gây khối u và vùng tạo các hợp chất opine được loại bỏ nhưng vẫn giữ lại vùng gen vir và vùng bờ trái
hoặc bờ phải. Thay vào những gen bị cắt bỏ là một vùng tương đồng với một đoạn trên plasmid thứ hai (plasmid trung gian) để phục vụ cho việc liên hợp hai loại vector. Plasmid trung gian là một loại plasmid tách dòng từ vi khuẩn E. coli và có
thể tái sinh được trong vi khuẩn Agrobacterium. Plasmid này chứa vùng gắn gen
cần chuyển nạp, các gen chỉ thị phục vụ việc chọn lọc và có mặt của đoạn tương đồng. Khi cho hai loại plasmid này tương tác với nhau chúng sẽ liên hợp qua sự trao đổi chéo hai đoạn tương đồng tạo nên vector liên hợp. Nhưng do tần suất đưa plasmid trung gian từ vi khuẩn E. coli sang vi khuẩn Agrobacterium rất thấp (10-7 – 10-5) nên hệ thống vector này ngày nay ít được sử dụng.
- Hệ thống vector nhị thể (binary vector).
Hệ thống vector nhị thể ra đời đã khắc phục được các nhược điểm của vector liên hợp. Một hệ thống vector nhị thể là một hệ thống sử dụng đồng thời hai vector độc lập có mặt trong tế bào vi khuẩn A. tumefaciens (một vector chính mang gen
mục tiêu cần chuyển và một vector hỗ trợ). Vector chính bao gồm các thành phần sau:
(1). Vị trí ghép nối đa điểm (MCS – Multi cloning sites), cho phép xen đoạn DNA ngoại lai vào dễ dàng.
(2). Đoạn khởi đầu tái bản có khả năng hoạt động trong cả vi khuẩn E. coli và A. tumefaciens.
(3). Gen chọn lọc hoạt động ở vi khuẩn và chọn lọc trực tiếp ở thực vật như gen kháng kháng sinh, gen β-glucuronidase, …
(4). Đoạn T-DNA ngoại biên (border).
Ngoài ra, trong vector nhị thể cịn có một số thành phần phụ trợ khác như gen kích thích vận chuyển T-DNA (T-DNA transfer stimulator sequence: TSS). Hệ
thống vector nhị thể thiết kế gồm hai vector (plasmid) cùng có mặt và hoạt động trong Agrobacterium. Một plasmid tách dịng từ vi khuẩn E. coli, trong đó có thiết
kế vùng bờ trái và bờ phải, nằm giữa hai bờ là các gen chỉ thị và vùng gắn gen cần chuyển. Plasmid thứ hai là Ti-plasmid cải tiến: toàn bộ vùng T-DNA và vùng bờ trái, bờ phải bị cắt bỏ chỉ giữ lại vùng gen vir hỗ trợ chuyển gen vào tế bào thực vật, plasmid này được gọi là plasmid hỗ trợ. Hệ thống vector nhị thể luôn được cải tiến để nâng cao hiệu suất chuyển gen thơng qua Agrobacterium [14]. Chính vì vậy, đây là một hệ thống vector được sử dụng phổ biến hiện nay, một trong số đó là vector pCAMBIA1301.