(A): Mảnh lá chuyển gen arsC được nuôi cấy trên môi trường đồng nuôicấy
(B): Mảnh lá chuyển gen arsC được nuôi cấy trên môi trường chọn lọc gen lần 1 có bổ sung Cefotaxime 500 mg/l và Hygromycin5 mg/l.
(C): Mảnh lá đối chứng nuôi cấy trên môi trường khơng có kháng sinh
(D): Mảnh lá đối chứng được nuôi cấy trên môi trường chọn lọc gen lần 1 có bổ sung Cefotaxime 500 mg/l và Hygromycin5 mg/l.
Giai đoạn chọn lọc cụm chồi sau chuyển gen
Khi những cụm chồi từ các mảnh lá tái sinh đa chồi tốt, ta tiến hành tách từng chồi riêng rẽ và được chuyển sang mơi trường chọn lọc cây chuyển gen lần 2có bổ sung Cefotaxime 400 mg/l và Hygromycin 10 mg/l (CT3 – phụ lục 4)để tiếp tục sàng lọc những cụm chồi mang gen arsC( hình 3.10).
Hình 3.10. Hình ảnh chồi thuốc lá trong mơi trường chọn lọc gen lần 2 có bổ sung
Cefotaxime 400 mg/l và Hygromycin10 mg/l.
Chúng tôi nhận thấy rằng trong cùng mơi trường chọn lọc cây chuyển gen lần 2 có bổ sung Cefotaxime 400 mg/l và Hygromycin 10 mg/l, những chồi chưa được
chuyển gen sẽ dần chuyển sang màu vàng, những chồi thuốc lá được chuyển gen thành công sẽ phát triển xanh tốt.
Giai đoạn chọn lọc cây tái sinh hoàn chỉnh
Từ những chồi phát triển mạnh ở môi trường chọn lọc cây chuyển gen lần 2 (CT3) ta chuyển chúng sang môi trường ra rễ có bổ sung NAA 0.1 mg/l, Cefotaxime 400 mg/l và Hygromycin 10 mg/l (CT4 - phụ lục 4).
(A) (B)
(C)
Hình 3.11.Hình ảnh cây thuốc lá tái sinh hồn chỉnh sau 2 tuần nuôi cấy
(A):Cây thuốc lá chuyển gen tái sinh hồn chỉnh trên mơi trường ra rễ có kháng sinh Cefotaxime 400 mg/l +Hygromycin 10 mg/l.
(B): Cây đối chứng và cây chuyển gen cấy trên môi trường ra rễ có kháng sinh Cefotaxime 400 mg/l+Hygromycin 10 mg/l.
Đối với cây thuốc lá, chồi cũng có thể ra rễ ngay trên mơi trường đa chồi có bổ sung kháng sinh cefotaxime 400 mg/l và hygromycin 10 mg/l nhưng tỷ lệ ra rễ ít hơn so với mơi trường ra rễ có bổ sung thêm NAA 0.1 mg/l.Hình 3.11A cho thấy, cây thuốc lá mang gen arsCsinh trưởng và phát triển khỏe mạnh trong môi trường ra rễ và tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Hình 3.11B, trong mơi trường ra rễ có bổ sung kháng sinh cây chuyển gen có khả năng hình thành rễ và phát triển, cịn cây đối chứng không ra rễ, cây yếu, lá héo dần và chết sau 6 tuần nuôi cấy.Hình 3.11C, những cây đối chứng khơng chuyển gen được ni cấy trên mơi trường khơng có kháng sinh vẫn có khả năng ra rễ và phát triển bình thường.
Ta thấy rằng: các mảnh lá, cụm chồi và cây được chuyển gen có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt trên mơi trường có kháng sinh chọn lọc hygromycin và cefotaxime (vì cấu trúc plasmid pCAMBIA1301-arsC có gen kháng kháng sinh hygromycin hpt (hygromycin phosphostransferase-hpt), khi được lây nhiễm vào các mảnh thuốc lá,gen này có khả năng tạo ra sản phẩm ức chế tác động của hygromycin được bổ sung trong môi trường chọn lọc). Cùng mơi trường đó các mảnh thuốc lá khơng chuyển gen có xu hướng ngả màu vàng ở mép lá, lan dần vào phiến lá và chết (trong mơi trường chọn lọc có bổ sung hygromycin, những mảnh lá, cụm chồi, cây không mang cấu trúc chuyển gen pCAMBIA1301-arsC cũng đồng thời không mang gen kháng hygromycin sẽ không thể tái sinh và phát triển được).
Tiến hành 3 lần bố trí thí nghiệm, ta thu được kết quả về khả năng hình thành và phát triển của cây thuốc lá mang cấu trúc pCAMBIA1301-arsC trong bảng 3.1 dưới đây:
Bảng 3.1. Khả năng hình thành và phát triển của cây thuốc lá chuyển cấu trúc
vector pCAMBIA1301 tái tổ hợp mang gen đích.
WT1: Mảnh lá thuốc lá khơng chuyển gen trên mơi trường có bổ sung kháng sinh. WT2: Mảnh lá thuốc lá không chuyển gen trên mơi trường khơng có kháng sinh.
Từ bảng 3.1 ta thấy rằng: Với tổng số 136 mảnh lá được biến nạp A. tumefaciens-pCAMBIA1301-arsC trong 3 lần thí nghiệm, có tỉ lệ hình thành chồi
trung bình khoảng 90.3%. Ta thực hiện tách và chọn ra 128 chồi để tiếp tục nuôi cấy qua các môi trường chọn lọc và môi trường ra rễ, kết quả cho ta về tỉ lệ số chồi có khả năng ra rễ trung bình khoảng 90.7%. Thí nghiệm thứ 2, các mảnh lá không chuyển gen được ni cấy trên mơi trường chọn lọc có bổ sung kháng sinh. Ta thấy rằng các mảnh lá này khơng có khả năng hình thành chồi, các mảnh lá này sẽ bị vàng từ mép lá lan dần vào trong, rồi dẫn đến chết. Thí nghiệm thứ 3, các mảnh lá khơng chuyển gen được ni cấy trên mơi trường MS khơng có bổ sung kháng sinh. Ta thấy các mảnh lá này vẫn có khả năng hình thành chồi, phát triển và ra rễ để hình thành cây bình thường.
Như vậy có thể kết luận đã hồn thành việc chuyển gen và chọn cây in vitro
sau chuyển gen. Nhìn chung tỷ lệ tái sinh của các mẫu chuyển gen arsC là cao. Qua các giai đoạn chọn lọc in vitro, từ 136 mảnh lá chuyển gen trong 3 lơ thí nghiệm đã thu được 28 dịng thuốc lá chuyển gen arsC phát triển tốt, lá xanh đậm, chồi mập, rễ dài, nhiều. Để tránh rủi ro mất dòngkhi trồng ra môi trường tự nhiên, các dòng thuốc lá mang gen arsC này sẽ được tiến hành nhân nhanh in vitro trước.
Giai đoạn ra cây vào giá thể đất: trấu: cát
Chọn mỗi dòng 3 cây sinh trưởng và phát triển tốt trong in vitro sau 1 tháng ni cấy được trồng ngồi tự nhiên trên giá thể trấu: đất: cát (tỷ lệ 1:1:1). Để cây thích nghi dần với mơi trường đất và tránh mất nước đột ngột dẫn đến cây chết, sau khi đã ra cây vào bầu đất, cho vào túi ni lông sạch, ghim giữ ở phần trên túi và cho lại vào phịng ni cây điều khiển nhiệt độ 25-28oC, cường độ ánh sáng 2000 lux, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày để cây phát triển ổn định. Sau 7 ngày đưa cây ra nhà lưới để cây thích nghi với điều kiện ánh sáng tự nhiên. Trong tổng số 28 dịng có 24 dịng cây thuốc lá phát triển tốt. Với đặc điểm là hệ rễ phụ của cây thuốc lá phát triển mạnh, có thể phát triển những đốt thân gần gốc nên tỷ lệ sống của các dòng khi vào giá thể khá cao (>85%), chứng tỏ cây thích nghi với điều kiện ngoại cảnh khá tốt (hình 3.12 A + B).
(A) (B)
Hình 3.12. Cây thuốc lá hồn chỉnh được trồng trong bầu đất: trấu: cát
(A): Cây thuốc lá chuyển gen được trồng ở bầu đất sau 15 ngày (B): Cây thuốc lá chuyển gen sau 45 ngày ra cây
Tác giả Nguyễn Thu Trang đã thiết kế vector chuyển gen GSHI vào cây thuốc lá. Đây cũng là một gen có khả năng tích lũy asen. Tác giả đã thu được 114 dòng cây ra rễ trên môi trường chứa kháng sinh chọn lọc [21]. Dhankher và cộng sự cũng đã chuyển đồng thời gen arsC với gen khởi động rubisco từ đậu tương (SRS1p) và gen γ-ECS với gen khởi động actin của nấm men (ACT2p) vào Arabidopsis đã tạo ra cây chuyển gen có khả năng chống chịu và tích lũy asen cao nhiều lần so với cây đối chứng [39].
Tóm lại, việc chuyển gen arsC vào cây thuốc lá, chọn lọc sau chuyển gen, tái sinh thành cây hồn chỉnh trên mơi trường chọn lọc và trồng cây vào bầu đất đã đạt được kết quả bước đầu. Các dòng thuốc lá chuyển gen đã sẵn sàng cho việc đánh giá tiếp theo.
3.4. Kiểm tra cây thuốc lá chuyển gen đƣợc trồng ngoài tự nhiên
3.4.1. Kiểm tra cây thuốc lá chuyển gen bằng kỹ thuật PCR
Sau 3 tuần trồng ngoài tự nhiên, những mảnh lá non của 24 dòng thuốc lá chuyển gen được tách chiết DNA tổng số (hình 3.13) phục vụ cho phản ứng PCR.
Hình 3.13. Kết quả điện di DNA tổng số của 24 dòng thuốc lá chuyển gen
1- 24: dòng thuốc lá chuyển gen từ 1 – 24 M: marker Fermentas 1kb
Kết quả điện di cho thấy các băng đều và rõ nét, chúng tôi kết luận đã tách chiết thành cơng ADNcủa các dịng thuốc lá chuyển gen. Tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu để nhân gen arsC và sử dụng DNA tổng số của 24 dòng thuốc lá chuyển gen làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR nhằm xác định sự có mặt của gen arsC trong các dịng thuốc lá này.Kết quả điện di sản phẩm PCR thể hiện trên hình 3.14.
Hình 3.14. Kết quả điện di sản phẩm PCR của các dòng thuốc lá chuyển gen
1 – 24: Sản phẩm PCR của dòng thuốc lá chuyển gen 1-24 M: Marker 100 bp DNA Ladder
Kết quả trên hình 3.14 cho thấy, trong số 24 dòng thuốc lá chuyển gen
arsCsau 3 tuần trồng ngoài tự nhiên được kiểm tra bằng phản ứng PCR, 12 dòng đã
cho kết quả dương tính. Từ 12 dịng thuốc lá chuyển gen này đều nhân được một băng khoảng 500 bp, phù hợp với kích thước lý thuyết của gen arsC. Chứng tỏ gen
arsC đã được chuyển thành cơng vào 12 dịng thuốc lá trên.
Tác giả Nguyễn Thu Trang đã kiểm tra được sự có mặt của gen GSHI ở 18 cây chuyển gen bằng phản ứng PCR cho thấy có 8/18 dịng cây cho kết quả dương tính (chiến tỷ lệ 44.4%) [21]. Tác giả Bùi Phương Thảo và cộng sự đã thiết kế thành công vector chuyển gen Lsi2 vào cây thuốc lá góp phần nâng cao khả năng vận chuyển và tích lũy asen. Kết quả kiếm tra bằng PCR có 9/10 dịng cây cho kết quả dương tính [18].
3.4.2. Kết quả kiểm tra cây thuốc lá chuyển gen bằng Southern Blot.
Để chứng minh gen arsC được chuyển vào genome của cây thuốc lá, chúng tôi sử dụng phương pháp lai Southern Blot. Kết quả của lai Southern Blot sẽ cho ta
biết thông tin về số lượng bản sao gen, tức là số lượng gen arsC được gắn vào
genome của cây thuốc lá.
Sau khi đánh giá cây chuyển gen bằng PCR, chúng tôi thu hỗn hợp lá non của các dòng thuốc lá chuyển genđã cho kết quả PCR dương tính để đánh giá bằng lai Southern Blot. DNA tổng số của các dòng 2, 6, 9, 13, 14, 17 tương ứng với các dòng thuốc lá chuyển gen cho kết quả PCR dương tính và cây đối chứng không chuyển gen đã được cắt bằng enzyme hạn chế HindIII; sản phẩm PCR gen arsC từ
pCAMBIA1301-arsC được cắt bằng 2 enzyme hạn chế NcoI và Eco72I. Sở dĩ
chúng tôi chọn enzyme HindIII vì enzyme này khơng có điểm cắt trong trình tự của gen arsC. Do thời gian có hạn nên đề tài mới chỉ đánh giá được 6 dòng thuốc lá chuyển gen và cho kết quả ở hình 3.15.
.
Hình 3.15. Kết quả lai Southern Blot
(-): cây thuốc lá không chuyển gen arsC
(+): sản phẩm PCR arsC từ plasmid pCAMBIA1301-arsC 1-6: DNA tổng số của dòng chuyển gen được cắt bởi HindIII.
Theo như hình 3.15 ta thấy rằng sản phẩm PCR gen arsC từ plasmid pCAMBIA1301-arsC cho 1 vạch băng tương ứng với gen arsC. DNA tổng số được cắt bởi HindIIIcho kết quả lai Southern Blot các dòng thuốc lá chuyển gen số 1, 4, 6 cho 1 vạch băng ngang nhau chứng tỏ các dịng thuốc lá này có 1 bản copy ở trong
cây và vị trí gắn của gen arsC trong genome của các dịng thuốc lá có khả năng là
cùng một vị trí. Trong khi đó, ở đối chứng âm cũng như ở các dòng thuốc lá 2, 3, 5 không cho vạch băng nào. Chứng tỏ quá trình chuyển gen arsC vào cây thuốc lá 1, 4, 6 (tương ứng với các dòng thuốc lá số 2, 13, 17) đã thành công.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận
- Biến nạp thành công chủng E. coli DH5α và chủng A. tumefaciens C58 mang vector pCAMBIA1301-arsC.
- Tạo được 24 dòng thuốc lá chuyển gen mang gen arsC sống sót trên mơi
trường chứa kháng sinh chọn lọc Cefotaxime và Hygromycin trong in vitro và ngoài tự nhiên.
- Đã kiểm tra được sự có mặt của gen arsC trong cây thuốc lá trồng ngoài tự nhiên bằng kỹ thuật PCR và chứng minh thành công bằng lai Southern Blot.
Kiến nghị
- Cần tiếp tục đánh giá khả năng tích lũy asen và đánh giá tính ổn định di truyền ở các thế hệ sau của các dòng thuốc lá mang gen arsC thu được.
- Mở rộng triển khai ứng dụng chủng A. tumefaciens C58 mang cấu trúc
vector pCAMBIA1301-arsC để nghiên cứu chuyển gen ở các cây trồng khác nhằm mục đích tích lũy Asen cải tạo môi trường bị ô nhiễm Asen.
- Dựa trên những kết quả nghiên cứu của đề tài và điều kiện của từng vùng ơ nhiễm cụ thể có thể tiếp tục tạo những cây trồng chuyển gen khác nhằm mục đích cải tạo mơi trường.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Đỗ Văn Ái, Mai Trọng Nhuận, Nguyễn Khắc Vinh (2005), Một số đặc điểm phân bố Arsen trong tự nhiên và vấn đề ô nhiễm arsen trong môi trường ở nước ta, Báo cáo của Cục địa chất và khoáng sản Việt Nam.
2. Đặng Thị An (2005), Nghiên cứu khả năng chống chịu kim loại nặng ở một số loài thực vật, Đề tài nghiên cứu cấp Viện sinh thái và Tài nguyên sinh vật
2005-2006.
3. Bùi Thị Kim Anh (2011), Nghiên cứu sử dụng thực vật (dương xỉ) để xử lý ô nhiễm Asen trong đất vùng khai thác khống sản, Luận án Tiến sĩ Mơi trường
đất và nước, Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội.
4. Bernard R. Glick, Jack J. Pasternak (2009), Công nghệ sinh học phân tử - Nguyên lý và ứng dụng của ADN tái tổ hợp, Nxb Khoa học và kĩ thuật.
5. Nguyễn Văn Bình, Nguyễn Đức Quý, Vũ Minh Quân, Lê Quang Thành (2000), “Sự phân bố và phát tán KLN trong đất và nước khu vực mỏ thiếc Sơn Dương”, Tạp chí các khoa học về trái đất, 22(2), tr. 134-139.
6. Nguyễn Tiến Cư, Trần Văn Tựa, Đặng Đình Kim, Đỗ Tuấn Anh, Lê Thu Thủy (2007), “Nghiên cứu khả năng xử lý chì (Pb) trong đất ô nhiễm bằng cây cỏ
Vetiver zizannioides”, Tuyển tập báo cáo Hội nghị khoa học Viện Công nghệ môi trường - Nghiên cứu và ứng dụng - Kỉ niệm 5 năm thành lập Viện công nghệ môi trường, Viện KH &CN Việt Nam, Hà Nội, 29-30/10/2007, tr. 308-312.
7. Phạm Văn Khang, Nguyễn Ngọc Minh, Nguyễn Xuân Huân (2004), “Một số nghiên cứu về kim loại nặng trên thế giới”, Tạp chí khoa học đất, 20, tr. 157- 161.
8. Lê Văn Khoa, Nguyễn Xuân Cự, Trần Thiện Cường, Nguyễn Đình Đáp (2010),
Giáo trình ơ nhiễm mơi trường đất và biện pháp xử lý, Nhà xuất bản giáo dục
9. Đặng Đình Kim (2010), Báo cáo tổng kết kết quả khoa học công nghệ đề tài nghiên cứu sử dụng thực vật để cải tạo đất bị ô nhiễm kim loại nặng tại các vùng khai thác khoáng sản, Chương trình KHNC cấp Nhà Nước KC08, Bộ
Khoa học và Cơng nghệ.
10. Lê Thanh Hịa (2003),Sinh học phân tử virus Gumboro nghiên cứu ứng dụng tại
Việt Nam, Nxb nông nghiệp, Hà Nội.
11. Diệp Thị Mỹ Hạnh, E. GarnierZarli (2007), “Lantana Canmara L., thực vật có khả năng hấp thu Pb trong đất để giải ô nhiễm”, Tạp chí phát triển khoa học và cơng nghệ, 10(1).
12. Đồng Thị Minh Hậu, Hoàng Thị Thanh Thủy, Đào Phú Quốc (2008), “Nghiên cứu và lựa chọn một số thực vật có khả năng hấp thu các kim loại nặng (Cr, Cu, Zn) trong bùn nạo vét kênh Tân hóa- Lị gốm”, Tạp chí phát triển khoa học và cơng nghệ, 11(4).
13. Lê Ðình Lương, Quyền Ðình Thi (2003), Kĩ thuật di truyền và ứng dụng, Nxb
đại học quốc gia Hà Nội.
14. Nguyễn Quang Thạch (2005), Giáo trình Cơng nghệ sinh học nơng nghiệp, Nxb Nơng nghiệp.
15. Khuất Hữu Thanh (2003), Cơ sở di truyền phân tử và kĩ thuật gen, Nxb Khoa học và kĩ thuật, Hà Nội.
16. Lê Duy Thành (2001), Cơ sở di truyền chọn giống thực vật, Nxb Khoa học và kĩ thuật, Hà Nội.
17. Nguyễn Ðức Thành (2003), Chuyển gen ở thực vật, Nxb Khoa học và kĩ thuật,
Hà Nội.
18. Bùi Phương Thảo, Hồng Thu Hằng, Phạm Bích Ngọc, Lê Văn Sơn, Chu Hồng Hà (2013), “ Thiết kế vector chuyển gen Lsi2 góp phần nâng cao khả năng vận chuyển và tích lũy asen trong thực vật”, Hội nghị khoa học Công nghệ Sinh