2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Chủng vi khuẩn sử dụng trong thí nghiệm
Tế bào vi khuẩn khả biến Escherichia coli (E. coli) DH5αvà tế bào vi khuẩn khả biến A. tumefaciens C58 do Phòng Di truyền tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học cung cấp.
2.1.2. Vật liệu sinh học phân tử
Sử dụng pCAMBIA1301 (phụ lục 1) làm vector gốc để thiết kế vector tái tổ hợp mang gen arsC.
Vector tách dòng pBT-arsC nhận được từ phòng Di truyền tế bào thực vật.Vector này là sản phẩm ghép nối của gen arsC (được tách và nhân dòng từ cây
dương xỉ Pteris vittata) được gắn vào vector tách dòng pBT để nhân dòng trong
nghiên cứu trước của phòng Di truyền tế bào thực vật.
Cặp mồi đặc hiệu (bảng 2.1) để nhân gen arsC (dựa vào trình tự gen arsC phụ lục 5 để thiết kế) do phòng Di truyền Tế bào thực vật, Viện công nghệ sinh học cung cấp.
Bảng 2.1. Trình tự cặp mồi đặc hiệu nhân gen arsC
2.1.3. Vật liệu thực vật
Dòng thuốc lá K326do Phòng Di truyền tế bào thực vật, Viện Cơng nghệ
2.1.4. Hóa chất
Dung dịch tách chiết plasmid: Dung dịch 1 (Sol I) (Tris-HCl 25 mM, pH 8.0; EDTA 10 mM, pH 8.0; Glucose 50 mM; H20); dung dịch 2 (Sol II) (NaOH 0.2 N; SDS 1 %); dung dịch 3 (Sol III) (đệm Potassium acetat 3M; Acetic acid 11.5%; H20);Isopropanol, Ethanol 70 %, Dung dịch chloroform: isoamyl alcohol (24:1).
Dung dịch điện di DNA: Dung dịch đệm TAE 50X (Tris-base: 121 g, Axit acetic glacia: 28.6 ml; 0,5 M EDTA pH 8.0: 50 ml; nước khử ion vừa đủ: 500 ml); dung dịch đệm TAE 1X; Agarose 0.8 %, 1 %; Ethidium bromide (EtBr) 0.5 µg/ml; Đệm kiểm tra mẫu DNA (Loading buffer); thang DNA 1 kb (Fermentas).
Kit tinh sạch DNA (Gene JETTM Gel Extraction KIT) của hãng Fermentas (Mỹ) cung cấp.
Các loại kháng sinh: kanamycin, cefotaxime, rifamycin và hygromycin.
Các hóa chất dùng trong Southern Blot: dung dịch biến tính (1.5 M NaCl, 0.5
M NAOH); dung dịch trung hòa (1.5 M NaCl, 0.5 M Tris HCl PH 7.2, 1 mM EDTA); SSC20X (3 M NaCl, 0.3 M Na3C6H507); giấy lọc Whaman 3 MM; màng lai nylon; giấy thấm....
Các hóa chất khác: H2O deion, dung dịch đệm Buffer Tango 10X, emzym cắt giới hạn NcoI, Eco72I và HindIII, buffer red, enzyme T4 DNA ligase, Buffer T4
DNA ligase 10X, enzyme Taq DNA polymerase.
2.1.5. Môi trường nuôi cấy
- Môi trường nuôi cấy vi khuẩn (phụ lục 3).
- Môi trường nuôi cấy MS theo Murashige và Skoog [52]và chọn lọc cây thuốc lá chuyển gen (phụ lục 4).
2.1.6. Máy móc và thiết bị
Máy PCR system 9700 (Applied Biosystem, Mỹ), máy điện di Powerpac 300 (Bio-Rad, Mỹ), máy soi DNA (Mini-transllumminatior, BioRad, Mỹ), máy chụp gel CLS – Microdoc (Cleaver Scientific Ltd, Mỹ), máy Voltex (Minishaker, IKA, Đức),
máy ly tâm, máy ổn nhiệt... và các trang thiết bị khác của phòng Di truyền tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Thiết kế vector pCambia1301 mang gen arsC