CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ
3.1. Thiết kế vector chuyển nạp mang gen arsC
3.1.2. Gắn gen arsC vào vector biểu hiện pCAMBIA1301
Vector pCAMBIA1301 và gen arsC (được nhân bằng cặp mồi đặc hiệu arsC-F/Rtừ vector tách dịng pBT-arsC)đều có chứa 1 điểm cắt của 2 enzyme giới
hạn NcoI và Eco72I. Do đó chúng tơi thực hiện phản ứng cắt đồng thời gen arsC và pCAMBIA1301 với 2 enzyme NcoI và Eco72I nhằm thay thế gen Gus trong vector
pCAMBIA1301 bằng gen arsC. Kết quả sản phẩm cắt được điện di trên gel agarose 1% thể hiện trên hình 3.2.
Hình 3.2. Kết quả kiểm tra pCAMBIA1301 và arsC được cắt bằng NcoI và Eco72I
M: Marker Fermentas 1Kb 1: pCAMBIA1301
2: pCAMBIA1301 được cắt bằng NcoI và Eco72I 3: arsC được cắt bằng NcoI và Eco72I
Điện di sản phẩm cắt cho kết quả: plasmid pCAMBIA1301 có kích thước khoảng 11 kb (giếng 1). Plasmid này đã được cắt bằng hai enzyme NcoI và Eco72I
cho 2 vạch (giếng 2), 1 vạch khoảng 9kb là của vector pCAMBIA1301 có chứa promoter CaMV 35S, gen kháng kháng sinh hygromycin và vạch cịn lại cho kích thước khoảng 2 kb tương ứng với đoạn gen Gus; gen arsC sau khi cắt cho 1 vạch
băng khoảng gần 500 bp (giếng 3).
Sản phẩm sau khi cắt được tiến hành tinh sạch gen mục tiêu arsC và
pCAMBIA1301 đã được mở vòng bằng bộ KIT của hãng Fermentas để nhằm thu lại đoạn gen mục tiêu đồng thời loại bỏ các tạp chất để cho q trình thiết kế vector có hiệu quả cao.
Khi dung dịch qua cột tinh sạch, DNA sẽ được gắn vào các phân tử có ái lực cao với chúng cố định trên màng lọc của cột. Dịch đệm cùng agarose
đượcloại bỏ nhờ ly tâm với tốc độ cao. DNA được thu lại bằng nướckhử ion. Sản phẩm tinh sạch được kiểm tra trên gel agarose 1 % thể hiện ở hình 3.3.
Hình 3.3. Kết quả kiểm tra sản phẩm tinh sạch pCAMBIA1301và gen arsC sau khi
cắt bằng enzyme NcoI và Eco72I
M: Marker Fermentas 1 kb
1: phân mảnh 9kb của pCAMBIA1301 cắt bằng NcoI và Eco72I (sau tinh sạch) 2: arsC được cắt bằng NcoI và Eco72I (sau tinh sạch)
Kết quả sản phẩm DNA tinh sạch (hình 3.3) có hàm lượng cao, khơng bị đứt gẫy, đúng với kích thước như tính tốn lý thuyết của gen arsC và vector pCAMBIA1301 đã loại bỏ Gus. Chứng tỏ quá trình tinh sạch đủ điều kiện để thực hiện phản ứng lai nhờ T4 ligase tạo vector tái tổ hợp pCAMBIA1301-arsC.