2.2.1.1 .Nuôi cấy và lưu giữ chủng
2.2.4.3. Nhiễm khuẩn và đồng nuôicấy
Ngâm các mảnh lá vào dịch huyền phù vi khuẩn, OD600 = 0.5 - 1 trong 10 phút, có lắc nhẹ. Mẫu cấy đươ ̣c thấm khô bằng giấy thấm khử trùng và đặt lên môi trường đồng nuôi cấy CT1 (phụ lục 4) trong tối 2 – 3 ngày.
2.2.4.4. Sàng lọc chồi thuốc lá chuyển gen trên mơi trường có kháng sinh chọn lọc
Sau 2 - 3 ngày đồng nuôi cấy, đặt các mảnh lá lên giấy thấm khô hết dịch khuẩn và chuyển lên mơi trường có bổ sung kháng sinh Cefotaxime 500 mg/l và Hygromycin5 mg/l CT2 (phụ lục 4). Sau 2 - 3 tuần, xuất hiện các cụm chồi nhỏ từ mép các mảnh lá. Tách các cụm chồi phân hóa mạnh, tiếp tục cấy lên môi trường CT2. Đến khi các chồi thật phát triển từ các cụm chồi thì tiến hành tách từng chồi riêng rẽ và cấy lên môi trường chọn lọc cây chuyển gen lần 2 có bổ sung Cefotaxime 400 mg/l và Hygromycin 10 mg/l CT3 (phụ lục 4).
2.2.4.5. Tái sinh cây hoàn chỉnh
Chọn những cây thuốc lá phát triển lớn trên môi trường CT3 chuyển sang mơi trường ra rễ có bổ sung NAA 0.1 mg/l, Cefotaxime 400 mg/l và Hygromycin 10 mg/l CT4 (phụ lục 4) để tạo cây hồn chỉnh.
2.2.4.6. Ra cây trên mơi trường đất : trấu : cát
Từ những dịng thuốc lá trên mơi trường ra rễ CT4 chọn lọc những dòng sinh trưởng phát triển mạnh để ra cây vào môi trường đất: trấu: cát (tỷ lệ 1:1:1).
2.2.5. Phương pháp phân tích cây chuyển gen
2.2.5.1. Phương pháp kiểm tra cây chuyển gen bằng PCR
Các cây thuốc lá tái sinh sau khi chuyển gen được tiến hành kiểm tra sự tồn tại của gen arsC bằng phản ứng PCR với mồi đặc hiệu được thiết kế ở trên. Mẫu lá
thuốc lá được tách chiết theo phương pháp của Saghai Maroof [57] làm khuôn cho phản ứng PCR, được tiến hành như sau:
Cắt mảnh lá bánh tẻ nghiền trong ni tơ lỏng thành dạng bột mịn cho vào eppendorf 2 ml. Bổ sung 500µl dung dịch đệm chiết CTAB, lắc nhẹ.Ngâm trong bể ổn nhiệt 65oC trong 5 phút, thỉnh thoảng đảo nhẹ.Bổ sung 150 µl 24:1, lắc đều, ủ đá 10 phút.Ly tâm 13.000 v/p trong 10 phút.Thu 500µl dịch nổi (pha trên) sang ống eppendorf 2 ml mới.Bổ sung 350 µl Isopropanol lạnh, lắc đều, để ở tủ -20oC trong 30 phút.Ly tâm 13.000 v/p trong 10 phút. Loại bỏ dịch nổi, thu tủa. Bổ sung 350 µl cồn 70% , lắc tan tủa.Ly tâm 13.000 v/p trong 5 phút thu tủa. Lặp lại 2 lần, làm khô trong box. Bổ sung 50 µl TE, dự trữ mẫu ở tủ -20oC.
Điện di sản phẩm trên gel agarose 1%. Các cây có phản ứng PCR cho sản phẩm dương tính được chọn lọc để tiếp tục nghiên cứu tiếp theo.
2.2.5.2. Lai Southern blot
Phương pháp: DNA tổng số chiết xuất từ lá non cây thuốc lá chuyển gen được cắt bởi HindIII là nguyên liệu cho quá trình lai Southern blot. Nguyên tắc của
Southern Blot là màng lai nitrocelllulose hoặc nylon có tích điện, có khả năng tiếp nhận DNA được biết từ lâu và được sử dụng trong các nghiên cứu lai acid nucleic khác nhau vào thập niên 1950 và 1960 của thế kỷ 20. Vào thời kỹ này, DNA cố định không được phân đoạn, chỉ đơn giản gồm DNA tổng số được gắn trên màng lai nitrocellulose. Sự ra đời của phương pháp điện di trên gel agarose vào đầu thập niên
1970 đã cho phép các đoạn DNA được cắt bởi enzyme hạn chế có thể được phân tách dựa trên cơ sở kích thước của chúng. Phương pháp này được Southern mô tả tại Đại học Edingburgh năm 1975. Phương pháp Southern Blot đơn giản, hiệu quả và rất chính xác. Theo Chopra và Anwan [37] và Glick và Jackj [45], Southern Blot gồm 6 bước:
Cắt DNA bằng enzyme hạn chế thích hợp.
Phân đoạn bằng điện di trên gel agarose.
Biến tính DNA (thơng thường khi nó cịn trên gel agarose) bằng cách nhúng vào dung dịch NaOH 0,5M; DNA sợi kép sẽ được tách thành DNA sợi đơn. Chỉ DNA sợi đơn mới có thể chuyển lên màng lai.
Chuyển DNA đã biến tính lên màng lai. Sử dụng màng nylon có khả năng giữ DNA chắc hơn và ít đứt gãy hơn. Việc chuyển DNA thường được tiến hành bằng phương thức mao dẫn trong khoảng vài giờ đến qua đêm hoặc có thể dùng một thiết bị thấm chân khơng. Nếu dùng thiết bị thấm chân khơng thì sẽ nhanh hơn, chỉ mất khoảng 1 tiếng. Trong q trình chuyển, vị trí các đoạn DNA vẫn được giữ ngun khơng thay đổi.
Lai DNA đã được cố định trên màng với mẫu dị DNA có đánh dấu. Q trình này dựa trên nguyên tắc bổ sung giữa DNA trên màng lai với mẫu dò.
Định vị các phân tử lai DNA-mẫu dò.
Trong chuyển gen, để chứng minh gen được chuyển và gắn kết vào genome, người ta sử dụng phương pháp Southern Blot, vì phương pháp này rất nhạy, cho kết quả chính xác, ít bị ảnh hưởng bởi DNA lẫn tạp khác, đồng thời có thể nhận được thơng tin về số lượng bản sao gen, nghĩa là số lượng gen chuyển gắn vào genome cây chuyển gen, Trong đề tài này, phương pháp Southern Blot được sử dụng để xác định sự có mặt và gắn gen nguyên vẹn của gen arsC trong genome của cây thuốc lá chuyển gen sau khi các cây này đã được sàng lọc bằng kháng sinh Cefotaxime và Hygromycin và được xác định sự có mặt của gen arsC bằng phương pháp PCR. a. Tạo mẫu lai
Tách chiết DNA giống thuốc lá K326 đã được chuyển gen arsC thông quaA.
tumefacienC58-pCAMBIA1301-arsC.Thực hiện phản ứng cắt DNA bằng các
enzyme giới hạn. Điện di và chuyển lên màng.
Quy trình chuyển DNA từ gel agarose lên màng nylon:
Rửa sạch gel bằng H20 deion, bổ sung dung dịch biến tính (1.5 M NaCl, 0.5 M NAOH) lắc đều ở nhiệt độ phòng.Rửa lại gel bằng H20 deion, bổ sung dung dịch trung hòa (1.5 M NaCl, 0.5 M Tris HCl pH 7.2, 1 mM EDTA). Lắc đều ở nhiệt độ phòng 15 phút. Đổ khay nhựa bằng buffer SSC20X (3 M NaCl, 0.3 M Na3C6H507 ), dùng một tấm kính làm cầu bắc ngang qua khay nhựa. Dùng 1 tấm giấy lọc Whaman 3 MM phủ lên trên miếng kính, 2 đầu giấy lọc nhúng chìm trong khay nhựa có chứa buffer SSC 20X. Làm ướt đều giấy lọc bằng buffer SSC 20X. Đặt gel agarose lên trên giấy lọc. Loại hết bọt khí nằm giữa giấy lọc và gel. Phủ màng nylon lên trên gel, chú ý loại hết bọt giữa nylon và gel, phủ 2-3 miếng giấy lọc Whatman 3 MM đã được làm ướt bằng buffer SSC 20X lên trên màng nylon, phủ lên trên giấy lọc 1 lớp giấy thấm dày, sau đó đặt 1 tấm kính nhỏ lên trên và chặn 1 quyển sách nhỏ lên trên cùng. Thí nghiệm được tiến hành qua đêm ở nhiệt độ phòng, bổ sung buffer SSC 20X vào khay nhựa khi cần thiết.Rửa màng nylon trong dung dịch SSC 2X, làm khơ ở nhiệt độ phịng và cố định DNA trên lớp màng bằng cách chiếu đèn UV trong 2 phút.
b. Tạo probe
Thực hiện phản ứng PCR với gen arsCsau đó tinh sạch sản phẩm PCR. Tiếp theo
thực hiện phản ứng đánh dấu như sau: Chuẩn bị mồi dị có gắn biotin theo kit của Fermentas và sử dụng ống 1.5 ml trong đó các thành phần sau:
Votex đều, ly tâm 3-5 giây cho mẫu khơng bám dính vào thành ống. Ủ trong nước sôi 5-10 phút, làm lạnh bằng cách cho vào đá, ly tâm 3 -5 giây để thu mẫu xuống dưới đáy. Bổ sung các thành phần sau vào trong ống:
Trộn đều, ly tâm 3 – 5 giây để thu mẫu, ủ mẫu ở 37oC trong 20 giờ. Dừng phản ứng bằng cách bổ sung 1 µl 0.5 M EDTA, pH 8.0. Mẫu có thể dùng ngay cho thí nghiệm hoặc lưu trữ ở -20o
C. c. Lai mẫu
Biến tính DNA tinh dịch cá hồi bằng cách ủ ở 100oC trong vòng 5 phút, làm lạnh trong đá và bố sung vào dung dịch lai cho tới nồng độ 50 – 100 µg/ ml. Đặt màng lai vào trong khay chứa dung dịch lai đã bổ sung DNA tinh dịch cá hồi biến tính, lắc 42oC trong 2 giờ. Mix mẫu dò được chuẩn bị trước, biến tính bằng cách ủ ở 100oC, 5 phút.Bổ sung hỗn hợp 2 mẫu dò vào trong dung dich lai tới nồng độ 25 – 100 ng/ml. Đổ bỏ dung dịch lai ở bước thứ 3, thay bằng dung dịch có bổ sung mẫu dị, ủ mẫu 42oC trong 12 giờ. Rửa lại màng lai bằng 2 lần dung dịch SSC 2X + SDS 0.1% trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Rửa lại 2 lần nữa trong dung dịch SSC 0.1X + SDS 0.1% trong 10 phút ở 65oC. Dùng giấy lọc Whatman 3MM làm khô màng lai.
d. Phát hiện mẫu dò trên màng lai (Fermentas Biotin Chromogenic Detection Kit) Chuẩn bị dung dịch thí nghiệm: Rửa màng lai với 30ml Blocking / Washing buffer trong 5 phút ở nhiệt độ phòng trên máy lắc.Rửa lại màng lai bằng cách lắc với 30ml Blocking solution trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Ủ màng lai với 20 ml dung dịch Streptavidin – Alkaline Phosphatase ở nhiệt độ phòng trong 30 phút , lắc đều trên máy lắc. Rửa màng lai 2 lần với 60 ml Blocking /Washing buffer trong 15 phút. Ủ màng lai trong 20 ml buffer hiện trong 10 phút, lắc đều trên máy. Thực hiện
phản ứng enzyme giữa Alkaline Phosphatase với BCIP/NBT bằng cách ủ màng lai trong bóng tối với 10 ml cơ chất đã pha loãng, ủ màng lai qua đêm để phản ứng màu rõ nét. Rửa lại màng lai bằng nước khử trùng hai lần và chụp lại hình màng lai.
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ
3.1. Thiết kế vector chuyển nạp mang gen arsC
3.1.1. Sơ đồ vector pCAMBIA1301-arsC dự định thiết kế
Vật liệu cho thiết kế vector chuyển gen là vector pCAMBIA1301 và plasmid tái tổ hợp pBT-arsC. Vector pCAMBIA1301 có chứa promoter CaMV 35S là một promoter mạnh dùng để biểu hiện trong tế bào thực vật, vì vậy chúng tơi chọn promoter CaMV 35S để điều khiển gen arsC phục vụ cho quá trình chuyển gen vào cây thuốc lá đạt kết quả cao.
Hình 3.1. Sơ đồ cấu trúc vector pCAMBIA1301-arsC
3.1.2. Gắn gen arsC vào vector biểu hiện pCAMBIA 1301
Vector pCAMBIA1301 và gen arsC (được nhân bằng cặp mồi đặc hiệu arsC-F/Rtừ vector tách dòng pBT-arsC)đều có chứa 1 điểm cắt của 2 enzyme giới
hạn NcoI và Eco72I. Do đó chúng tơi thực hiện phản ứng cắt đồng thời gen arsC và pCAMBIA1301 với 2 enzyme NcoI và Eco72I nhằm thay thế gen Gus trong vector
pCAMBIA1301 bằng gen arsC. Kết quả sản phẩm cắt được điện di trên gel agarose 1% thể hiện trên hình 3.2.
Hình 3.2. Kết quả kiểm tra pCAMBIA1301 và arsC được cắt bằng NcoI và Eco72I
M: Marker Fermentas 1Kb 1: pCAMBIA1301
2: pCAMBIA1301 được cắt bằng NcoI và Eco72I 3: arsC được cắt bằng NcoI và Eco72I
Điện di sản phẩm cắt cho kết quả: plasmid pCAMBIA1301 có kích thước khoảng 11 kb (giếng 1). Plasmid này đã được cắt bằng hai enzyme NcoI và Eco72I
cho 2 vạch (giếng 2), 1 vạch khoảng 9kb là của vector pCAMBIA1301 có chứa promoter CaMV 35S, gen kháng kháng sinh hygromycin và vạch cịn lại cho kích thước khoảng 2 kb tương ứng với đoạn gen Gus; gen arsC sau khi cắt cho 1 vạch
băng khoảng gần 500 bp (giếng 3).
Sản phẩm sau khi cắt được tiến hành tinh sạch gen mục tiêu arsC và
pCAMBIA1301 đã được mở vòng bằng bộ KIT của hãng Fermentas để nhằm thu lại đoạn gen mục tiêu đồng thời loại bỏ các tạp chất để cho q trình thiết kế vector có hiệu quả cao.
Khi dung dịch qua cột tinh sạch, DNA sẽ được gắn vào các phân tử có ái lực cao với chúng cố định trên màng lọc của cột. Dịch đệm cùng agarose
đượcloại bỏ nhờ ly tâm với tốc độ cao. DNA được thu lại bằng nướckhử ion. Sản phẩm tinh sạch được kiểm tra trên gel agarose 1 % thể hiện ở hình 3.3.
Hình 3.3. Kết quả kiểm tra sản phẩm tinh sạch pCAMBIA1301và gen arsC sau khi
cắt bằng enzyme NcoI và Eco72I
M: Marker Fermentas 1 kb
1: phân mảnh 9kb của pCAMBIA1301 cắt bằng NcoI và Eco72I (sau tinh sạch) 2: arsC được cắt bằng NcoI và Eco72I (sau tinh sạch)
Kết quả sản phẩm DNA tinh sạch (hình 3.3) có hàm lượng cao, khơng bị đứt gẫy, đúng với kích thước như tính tốn lý thuyết của gen arsC và vector pCAMBIA1301 đã loại bỏ Gus. Chứng tỏ quá trình tinh sạch đủ điều kiện để thực hiện phản ứng lai nhờ T4 ligase tạo vector tái tổ hợp pCAMBIA1301-arsC.
3.1.3. Biến nạp pCAMBIA1301-arsC vào tế bào khả biến E. coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt phương pháp sốc nhiệt
Plasmid tái tổ hợp được tạo ra từ phản ứng lai sẽ được biến nạp vào tế bào khả biến E.Coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt để chọn lọc, nhân nhanh plasmid với số lượng lớn. Sản phẩm của q trình biến nạp sau 16 giờ ni cấy LB đặc có bổ
sung kanamycin 50 mg/l ở 37oC cho các khuẩn lạc có màu trắng và nằm riêng rẽ với nhau (hình 3.4).
Hình 3.4. Khuẩn lạc E. Coli DH5α mọc trên mơi trường có bổ sung kháng sinh
Kanamycin 50mg/l.
3.1.4 Kết quả kiểm tra vector pCAMBIA1301 – arsC
3.1.4.1. Kết quả kiểm tra vector pCAMBIA1301-arsC bằng phản ứng PCR – colony colony
Các dịng khuẩn lạc mọc trên mơi trường có kháng sinh chọn lọc Kanamycin 50 mg/l chưa chắc chắn đã là các dòng mang plasmid tái tổ hợp, chúng có thể là các khuẩn lạc mang plasmid tự đóng vịng, hoặc mang gen đích bị đứt gãy. Vì vậy, để chọn lọc dịng khuẩn lạc mang vector chứa gen đích, chúng tơi chọn các khuẩn lạc trắng và thực hiện phản ứng PCR – colony với cặp mồi đặc hiệu cho gen, kết quả thể hiện trên hình 3.5.
Hình 3.5. Ảnh điện di kiểm tra các dòng khuẩn lạc bằng PCR - colony
M: Marker Fermentas 1Kb 1, 2, 3, 4: các dòng khuẩn lạc (+): pBT-arsC
(-): pCAMBIA1301
Kết quả trên hình 3.5 cho thấy: hai khuẩn lạc 1 và 2 trên mơi trường có kháng sinh chọn lọc cho kết quả dương tính. Hai mẫu dương tính đều lên 1 vạch băng duy nhất có kích thước khoảng 500bp phù hợp với kích thước của gen
arsCtheo tính tốn lý thuyết. Chứng tỏ 2 trong số 4 khuẩn lạc mang plasmid
pCAMBIA1301 – arsC. Mẫu đối chứng dương là plasmid pBT-arsC cũng cho vạch băng tương ứng của gen arsC khoảng 500 bp. Mẫu đối chứng âm vector
pCAMBIA1301 khơng có vạch băng nào, chứng tỏ vector khơng có sẵn gen arsC.
3.1.4.2. Kết quả kiểm tra vector pCAMBIA1301-arsC bằng enzyme giới hạn NcoI và Eco72I NcoI và Eco72I
Để khẳng định thêm các dòng khuẩn lạc trên mang plasmid tái tổ hợp mong muốn, chúng tôi tiến hành lấy các plasmid trên đem thực hiện phản ứng cắt
bằng enzyme giới hạn NcoI và Eco72I, kết quả điện di sản phẩm cắt thể hiện ở hình 3.6.
Hình 3.6. Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm cắt vector pCAMBIA1301 - arsC bằng
enzyme giới hạn NcoI và Eco72I.
M: Marker Fermentas 1Kb
1, 2: Plasmid của dòng khuẩn lạc
1’, 2’: Plasmid của các dòng khuẩn lạc ðýợc cắt bằng enzyme giới hạn NcoI và Eco72I.
Kiểm tra sản phẩm cắt của vector pCAMBIA1301-arsC trên gel agrose 1% được thể hiện ở giếng 1’, 2’ (hình 3.6): cho 2 vạch có kích thước khoảng 9kb và 500 bp tương ứng với vector pCAMBIA1301 đã loại bỏ gen Gus và gen arsC theo lý thuyết. Như vậy plasmid tái tổ hợp pCAMBIA1301-arsC được thiết kế thành công.
Vậy qua kiểm tra bằng xử lý enzyme giới hạn và phản ứng PCR – colony cho kết quả tốt. Do đó chúng tơi có thể khẳng định vector pCAMBIA1301 – arsC biến nạp thành công vào vi khuẩn E.coli chủng DH5α.
3.2.Biến nạp vector pCAMBIA1301 – arsC vào vi khuẩn A. tumefaciens
Chúng tơi sử dụng 5-10 µl plasmid pCAMBIA1301-arsC đã được thiết kế thành công ở trên để biến nạp vào tế bào khả biến A. tumefaciens bằng phương pháp xung điện. Sản phẩm của quá trình biến nạp được ni trên mơi trường LB đặc có chứa Kanamycin 50 mg/l và Rifamycin 50 mg/l, ủ đĩa ở 28oC, sau 2 ngày nuôi cấy, kết quả thu được một lượng lớn khuẩn lạc trên đĩa thạch trong đó có nhiều khuẩn lạc trịn, nằm độc lập, thể hiện ở hình 3.7.
Hình 3.7. Ảnh kết quả biến nạp vector pCAMBIA1301-arsC vào vi khuẩnA.
tumefaciens
Các khuẩn lạc có thể chứa plasmid tự đóng vịng hoặc gen bị đứt gãy. Vì vậy, để chọn ra những dòng khuẩn lạc như mong muốn (mang vector chuyển gen), chúng tôi đã tiến hành kiểm tra bằng phản ứng PCR – colony. Kết quả kiểm tra vector pCAMBIA1301-arsC được biến nạp vào A. tumefaciens bằng phản ứng PCR - colony, thể hiện ở hình 3.8.
Hình 3.8.Ảnh điện di sản phẩm PCR-colony của 7 khuẩn lạc A. tumefaciens C58