2.2.1.1 .Nuôi cấy và lưu giữ chủng
2.2.5. Phương pháp phân tích cây chuyển gen
2.2.5.1. Phương pháp kiểm tra cây chuyển gen bằng PCR
Các cây thuốc lá tái sinh sau khi chuyển gen được tiến hành kiểm tra sự tồn tại của gen arsC bằng phản ứng PCR với mồi đặc hiệu được thiết kế ở trên. Mẫu lá
thuốc lá được tách chiết theo phương pháp của Saghai Maroof [57] làm khuôn cho phản ứng PCR, được tiến hành như sau:
Cắt mảnh lá bánh tẻ nghiền trong ni tơ lỏng thành dạng bột mịn cho vào eppendorf 2 ml. Bổ sung 500µl dung dịch đệm chiết CTAB, lắc nhẹ.Ngâm trong bể ổn nhiệt 65oC trong 5 phút, thỉnh thoảng đảo nhẹ.Bổ sung 150 µl 24:1, lắc đều, ủ đá 10 phút.Ly tâm 13.000 v/p trong 10 phút.Thu 500µl dịch nổi (pha trên) sang ống eppendorf 2 ml mới.Bổ sung 350 µl Isopropanol lạnh, lắc đều, để ở tủ -20oC trong 30 phút.Ly tâm 13.000 v/p trong 10 phút. Loại bỏ dịch nổi, thu tủa. Bổ sung 350 µl cồn 70% , lắc tan tủa.Ly tâm 13.000 v/p trong 5 phút thu tủa. Lặp lại 2 lần, làm khô trong box. Bổ sung 50 µl TE, dự trữ mẫu ở tủ -20oC.
Điện di sản phẩm trên gel agarose 1%. Các cây có phản ứng PCR cho sản phẩm dương tính được chọn lọc để tiếp tục nghiên cứu tiếp theo.
2.2.5.2. Lai Southern blot
Phương pháp: DNA tổng số chiết xuất từ lá non cây thuốc lá chuyển gen được cắt bởi HindIII là nguyên liệu cho quá trình lai Southern blot. Nguyên tắc của
Southern Blot là màng lai nitrocelllulose hoặc nylon có tích điện, có khả năng tiếp nhận DNA được biết từ lâu và được sử dụng trong các nghiên cứu lai acid nucleic khác nhau vào thập niên 1950 và 1960 của thế kỷ 20. Vào thời kỹ này, DNA cố định không được phân đoạn, chỉ đơn giản gồm DNA tổng số được gắn trên màng lai nitrocellulose. Sự ra đời của phương pháp điện di trên gel agarose vào đầu thập niên
1970 đã cho phép các đoạn DNA được cắt bởi enzyme hạn chế có thể được phân tách dựa trên cơ sở kích thước của chúng. Phương pháp này được Southern mô tả tại Đại học Edingburgh năm 1975. Phương pháp Southern Blot đơn giản, hiệu quả và rất chính xác. Theo Chopra và Anwan [37] và Glick và Jackj [45], Southern Blot gồm 6 bước:
Cắt DNA bằng enzyme hạn chế thích hợp.
Phân đoạn bằng điện di trên gel agarose.
Biến tính DNA (thơng thường khi nó cịn trên gel agarose) bằng cách nhúng vào dung dịch NaOH 0,5M; DNA sợi kép sẽ được tách thành DNA sợi đơn. Chỉ DNA sợi đơn mới có thể chuyển lên màng lai.
Chuyển DNA đã biến tính lên màng lai. Sử dụng màng nylon có khả năng giữ DNA chắc hơn và ít đứt gãy hơn. Việc chuyển DNA thường được tiến hành bằng phương thức mao dẫn trong khoảng vài giờ đến qua đêm hoặc có thể dùng một thiết bị thấm chân khơng. Nếu dùng thiết bị thấm chân khơng thì sẽ nhanh hơn, chỉ mất khoảng 1 tiếng. Trong q trình chuyển, vị trí các đoạn DNA vẫn được giữ nguyên không thay đổi.
Lai DNA đã được cố định trên màng với mẫu dị DNA có đánh dấu. Q trình này dựa trên ngun tắc bổ sung giữa DNA trên màng lai với mẫu dò.
Định vị các phân tử lai DNA-mẫu dò.
Trong chuyển gen, để chứng minh gen được chuyển và gắn kết vào genome, người ta sử dụng phương pháp Southern Blot, vì phương pháp này rất nhạy, cho kết quả chính xác, ít bị ảnh hưởng bởi DNA lẫn tạp khác, đồng thời có thể nhận được thông tin về số lượng bản sao gen, nghĩa là số lượng gen chuyển gắn vào genome cây chuyển gen, Trong đề tài này, phương pháp Southern Blot được sử dụng để xác định sự có mặt và gắn gen nguyên vẹn của gen arsC trong genome của cây thuốc lá chuyển gen sau khi các cây này đã được sàng lọc bằng kháng sinh Cefotaxime và Hygromycin và được xác định sự có mặt của gen arsC bằng phương pháp PCR. a. Tạo mẫu lai
Tách chiết DNA giống thuốc lá K326 đã được chuyển gen arsC thông quaA.
tumefacienC58-pCAMBIA1301-arsC.Thực hiện phản ứng cắt DNA bằng các
enzyme giới hạn. Điện di và chuyển lên màng.
Quy trình chuyển DNA từ gel agarose lên màng nylon:
Rửa sạch gel bằng H20 deion, bổ sung dung dịch biến tính (1.5 M NaCl, 0.5 M NAOH) lắc đều ở nhiệt độ phòng.Rửa lại gel bằng H20 deion, bổ sung dung dịch trung hòa (1.5 M NaCl, 0.5 M Tris HCl pH 7.2, 1 mM EDTA). Lắc đều ở nhiệt độ phòng 15 phút. Đổ khay nhựa bằng buffer SSC20X (3 M NaCl, 0.3 M Na3C6H507 ), dùng một tấm kính làm cầu bắc ngang qua khay nhựa. Dùng 1 tấm giấy lọc Whaman 3 MM phủ lên trên miếng kính, 2 đầu giấy lọc nhúng chìm trong khay nhựa có chứa buffer SSC 20X. Làm ướt đều giấy lọc bằng buffer SSC 20X. Đặt gel agarose lên trên giấy lọc. Loại hết bọt khí nằm giữa giấy lọc và gel. Phủ màng nylon lên trên gel, chú ý loại hết bọt giữa nylon và gel, phủ 2-3 miếng giấy lọc Whatman 3 MM đã được làm ướt bằng buffer SSC 20X lên trên màng nylon, phủ lên trên giấy lọc 1 lớp giấy thấm dày, sau đó đặt 1 tấm kính nhỏ lên trên và chặn 1 quyển sách nhỏ lên trên cùng. Thí nghiệm được tiến hành qua đêm ở nhiệt độ phòng, bổ sung buffer SSC 20X vào khay nhựa khi cần thiết.Rửa màng nylon trong dung dịch SSC 2X, làm khơ ở nhiệt độ phịng và cố định DNA trên lớp màng bằng cách chiếu đèn UV trong 2 phút.
b. Tạo probe
Thực hiện phản ứng PCR với gen arsCsau đó tinh sạch sản phẩm PCR. Tiếp theo
thực hiện phản ứng đánh dấu như sau: Chuẩn bị mồi dị có gắn biotin theo kit của Fermentas và sử dụng ống 1.5 ml trong đó các thành phần sau:
Votex đều, ly tâm 3-5 giây cho mẫu khơng bám dính vào thành ống. Ủ trong nước sôi 5-10 phút, làm lạnh bằng cách cho vào đá, ly tâm 3 -5 giây để thu mẫu xuống dưới đáy. Bổ sung các thành phần sau vào trong ống:
Trộn đều, ly tâm 3 – 5 giây để thu mẫu, ủ mẫu ở 37oC trong 20 giờ. Dừng phản ứng bằng cách bổ sung 1 µl 0.5 M EDTA, pH 8.0. Mẫu có thể dùng ngay cho thí nghiệm hoặc lưu trữ ở -20o
C. c. Lai mẫu
Biến tính DNA tinh dịch cá hồi bằng cách ủ ở 100oC trong vòng 5 phút, làm lạnh trong đá và bố sung vào dung dịch lai cho tới nồng độ 50 – 100 µg/ ml. Đặt màng lai vào trong khay chứa dung dịch lai đã bổ sung DNA tinh dịch cá hồi biến tính, lắc 42oC trong 2 giờ. Mix mẫu dị được chuẩn bị trước, biến tính bằng cách ủ ở 100oC, 5 phút.Bổ sung hỗn hợp 2 mẫu dò vào trong dung dich lai tới nồng độ 25 – 100 ng/ml. Đổ bỏ dung dịch lai ở bước thứ 3, thay bằng dung dịch có bổ sung mẫu dị, ủ mẫu 42oC trong 12 giờ. Rửa lại màng lai bằng 2 lần dung dịch SSC 2X + SDS 0.1% trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Rửa lại 2 lần nữa trong dung dịch SSC 0.1X + SDS 0.1% trong 10 phút ở 65oC. Dùng giấy lọc Whatman 3MM làm khơ màng lai.
d. Phát hiện mẫu dị trên màng lai (Fermentas Biotin Chromogenic Detection Kit) Chuẩn bị dung dịch thí nghiệm: Rửa màng lai với 30ml Blocking / Washing buffer trong 5 phút ở nhiệt độ phòng trên máy lắc.Rửa lại màng lai bằng cách lắc với 30ml Blocking solution trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Ủ màng lai với 20 ml dung dịch Streptavidin – Alkaline Phosphatase ở nhiệt độ phòng trong 30 phút , lắc đều trên máy lắc. Rửa màng lai 2 lần với 60 ml Blocking /Washing buffer trong 15 phút. Ủ màng lai trong 20 ml buffer hiện trong 10 phút, lắc đều trên máy. Thực hiện
phản ứng enzyme giữa Alkaline Phosphatase với BCIP/NBT bằng cách ủ màng lai trong bóng tối với 10 ml cơ chất đã pha loãng, ủ màng lai qua đêm để phản ứng màu rõ nét. Rửa lại màng lai bằng nước khử trùng hai lần và chụp lại hình màng lai.