2.2.1.1 .Nuôi cấy và lưu giữ chủng
2.2.1.2. Tách chiết plasmid tái tổ hợp từ tế bào vi khuẩn E.coli DH5α
Phương pháp này sử du ̣ng các dung d ịch Sol I, Sol II, Sol III để tách plasmid từ tế bào vi khuẩn , dựa trên nguyên lý sau : Sử du ̣ng EDTA để hòa tan că ̣n tế bào vi khuẩn, sau đó, sử du ̣ng SDS, NaOH để phá vỡ cấu trúc thành và làm bi ến tính các phân tửprotein, kết tủa protein bằng cách thay đổi pH của di ̣ch chiết tế bào , sau đó, ly tâm tốc đô ̣ cao để loa ̣i protein b ị kết tủa. DNA plasmid được tủa lại bằng ethanol 100% hoặc isopropanol. Lượng RNA còn tồn tại trong dung dịch chứa DNA plasmid được loại bỏ bằng cách bổ sung RNase. Quy trình tách chiết theo Sambrook và Russell [58]có cải tiến được tiến hành như sau:
Lấy 1.5 ml dịch khuẩn đã nuôi qua đêm cho vào ống eppendorf 1.5 ml. Ly tâm ở 8000 v/p trong 5 phút. Thu cặn tế bào ở đáy ống.
Bổ sung 100 µl dung dịch Sol I lạnh (Tris-HCl 25 mM, pH 8.0; EDTA 10 mM, pH 8.0), hòa tan hoàn toàn cặn tế bào bằng voltex.
Bổ sung 200 µl dung dịch Sol II (200 mM NaOH + SDS 1 %), đảo nhẹ, ủ trên đá 3 phút.
Bổ sung 150 µl dung dịch Sol III lạnh (Potassium acetat 3M; Acetic acid 11.5 %; H20), đảo nhẹ. Đặt trong đá 3 - 5 phút.
Ly tâm 13.000 v/p trong 15 phút ở 4oC. Thu dịch nổi, bỏ cặn.
Bổ sung chloroform : isoamyl alcohol (24 : 1) theo tỷ lệ 1 : 1, đảo nhẹ. Ly tâm 13.000 v/p trong 10 phút. Chuyển pha trên sang ống Eppendorf 1.5 ml mới.
Bổ sung isopropanol lạnh theo tỷ lệ 1:1, ủ ở -200C trong thời gian ít nhất là 30 phút.
Ly tâm ở 4oC, 13.000 v/p trong 20 phút, loại bỏ dịch trong, thu kết tủa DNA. Rửa kết tủa hai lần bằng 500 µl cồn 70 % lạnh. Ly tâm ở 4oC, 13.000 v/p trong 5 phút. Loại bỏ dịch phía trên và làm khô tủa.
Hồ tan tủa trong 50 µl nước khử ion vơ trùng hoặc TE có bổ sung RNase đến nồng độ cuối cùng là 30 µg/ml, để ở nhiệt độ phịng cho tan hồn tồn.
Bảo quản plasmid trong tủ -20oC để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo. Điện di kiểm tra trên gel agarose 1 %.