2.4 Phƣơng pháp
2.4.4 Phân loại nấm rễ nội cộng sinh
2.4.4.1 Phân loại AMF bằng phương pháp hình thái học
Chuẩn bị dung dịch Melzer [51,52]
Bước 1: Hoà tan 1,5g KI đến 20ml nước cất
Bước 2: Hòa tan 0,5g I2 trong dung dịch từ bước 1
Bước 3: Hoà tan 20g clorrat hydrat trong dung dịch từ bước 2
Bào tử đƣợc nhuộm bằng dung dịch thuốc thử Melzer. Từng bào tử đơn độc đã đƣợc quan sát, phân tích trƣớc và sau khi nhuộm chất thử của Melzer dƣới kính hiển vi. Nhận biết bào tử dựa vào màu sắc bào tử, kích thƣớc, bề mặt và cấu trúc vách, đối chiếu các mô tả và hình ảnh trong khóa phân loại của Bảo tàng nấm Mycorhiza Quốc tế của Đại học West Verginia (https://invam.wvu.edu/) và Schenck, Pertez, 1990 [62].
2.4.4.2 Lựa chọn các chủng nấm rễ nội cộng sinh có khả năng xâm nhiễm cao
Qua phân tích hình thái học, tiến hành lựa chọn các bào tử AMF có tần xuất bắt gặp cao nhất để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo [37]
2.4.4.3 Phân loại AMF bằng kỹ thuật sinh học phân tử a. Tách ADN
- Hút từng bào tử đơn độc vào ống eppendorf, dùng đầu côn phá vỡ bào tử. - Bổ sung 70µl đệm phá vỡ tế bào (100mM Tris-HCl (pH=8.0), 20mM Na2EDTA, 0.5 M NaCl và 1% sodium dodecylsµlfat).
- Sau đó thêm 70µl CI (hỗn hợp chloroform: isoamylacohol = 24:1); li tâm thƣờng 15000 vòng/ 5 phút. Lặp lại 2 lần bƣớc này.
- Hút ra 70µl dịch phía trên lớp huyền phù ra 1 ống eppendorf mới. Thêm 70µl isopropanol và 7µl sodium acetate 3M rồi bảo quản mẫu ở -20°C trong 2 giờ. Sau đó tiến hành li tâm lạnh 15000 vịng/15 phút để thu lấy kết tủa.
- Thêm 500µl ethanol 70%, li tâm lạnh 15000 vịng/15 phút (lặp lại bƣớc này 2 lần). Loại bỏ cồn, để khô tự nhiên.
- Thêm 50µl MQ để trong tủ -20oC dùng cho các bƣớc thí nghiệm tiếp theo.
b. Khuếch đại ADN
theo đó chúng tơi tiến hành PCR lồng (nested RCR) bằng mồi AML1 (5‟-ATC AAC TTTCGA TGG TAGGAT AGA-3‟) và AML2 (5‟-GAACCC AAA CAC TTT GGT TTC C-3‟) đặc hiệu cho AMF để nhân đoạn gen AML của chúng (Jaikoo Lee và cs, 2008). DNAr đƣợc khuếch đại trên máy GeneAmo PCR System 9700 (Appiled Biosystems), với các chu trình nhiệt nhƣ sau: đầu tiên ADN bị biến tính thành sợi đơn ở 94oC trong 3 phút, sau đó ADN đƣợc nhân đoạn ở 35 vịng, chu trình nhiệt nhƣ sau: (1) giai đoạn biến tính ADN thành sợi đơn ở 94oC trong vòng 30 giây, (2) giai đoạn bắt cặp - các cặp mồi tìm đến bắt cặp bổ sung vào 2 đầu của ADN đích: 50oC trong 60 giây, (3) cuối cùng nhiệt độ đƣợc nâng lên ở 72oC trong 1 phút nhiệt độ thích hợp cho enzyme Taq polymerase hoạt động; kết thúc nhân đoạn ADN: nâng nhiệt độ lên 72oC trong 5 phút, sau đó giảm xuống 4oC, giữ mẫu ở nhiệt độ này. Thành phần và chu kỳ của phản ứng PCR đƣợc thể hiện ở Bảng 2.2 và Bảng 2.3
Bảng 2.2.Thành phần của phản ứng PCR Tên Thể tích Tên Thể tích Master mix 21,0 µl H2O 24,0 µl NS1/ AML1 1,0 µl NS4/ AML2 1,0 µl ADN khn 2,0 µl Taq 1 µl Tổng 50 µl
Bảng 2.3. Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR
Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ
94 oC 3 phút 94 oC 30 giây 50oC 60 giây 35 chu kỳ 72oC 1 phút 72oC 5 phút 4oC ∞ c. Tinh sạch sản phẩm sau PCR
Mẫu đƣợc chuyển sang ống eppendoft 1,5ml. Thêm 5µl EDTA 1,25M, thêm 60µl ethanol 100%. Trộn nhẹ nhàng. Giữ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. Ly tâm 15000 vòng/phút trong 10 phút. Đổ bỏ dịch phía trên. Rửa bằng 10µl ethanol 70%. Ly tâm 15000 vòng/phút trong 10 phút. Làm khô mẫu bằng máy cô quay chân không trong 3-5 phút
d. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR
Quá trình điện di các sản phẩm của phản ứng PCR đƣợc thực hiện trên thạch agarose trong đệm TAE. Đun tan 0,8 % agarose trong dịch TAE (1x) (dung dịch 50x TAE: 2ml; nƣớc cất: 98ml; agarose: 0,8g) để ấm, đổ vào khuôn đã cắm lƣợc, đợi cho nguội và đặt tấm gel vào trong máy điện di. Lấy 1µl dung dịch dye, trộn đều với 3µl mẫu, nhỏ vào giếng. Chạy điện di bằng dòng điện một chiều với điện thế 100V, cƣờng độ dòng điện 80mA trong 30 phút, bỏ ra ngâm trong dung dịch ethidium bromua (nồng độ 0,5µl/ml) trong 20 phút, vớt ra quan sát. Quan sát trên máy soi gel.
e. Phân tích trình tự gen
Trình tự ADNr của AML đƣợc đọc trực tiếp trên máy đọc trình tự tự động (3100 Avant, ABI, Mĩ). Kết quả đọc trình tự đƣợc so sánh với các trình tự của các loài đã đƣợc xác định trong ngân hàng gen bằng chƣơng trình BLAST
(www.ncbi.nlm.nih.gov). Cây phả hệ đƣợc xây dựng bằng phần mềm Clustal X phiên bản 1.8 và NJ-tree [78].
2.4.4.4 Phương pháp phân tích số liệu thống kê
Tần suất xuất hiện (TSXH) của chi/lồi đƣợc tính theo cơng thức [37]: TSXH % = (số lƣợng mẫu xuất hiện chi/loài nấm nghiên cứu/tổng số mẫu nghiên
cứu) × 100%.
Chi/ lồi nấm có tần suất xuất hiện lớn hơn 10% đƣợc gọi là loài ƣu thế Mật độ bào tử: Số lƣợng bào tử/100g đất phân lập.
CHƢƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN