TT Mẫu Hà Nội Hà Nam
Tính chất đất
N01 Đất cứng, giàu dinh dƣỡng Đất cát, khô
N02 Đất cứng, giàu dinh dƣỡng Đất cứng, ƣớt, giàu dinh dƣỡng N03 Đất xốp, giàu dinh dƣỡng Đất cát, khô
N04 Đất xốp, giàu dinh dƣỡng Đất cát, khô
N05 Đất xốp, giàu dinh dƣỡng Đất cứng, ƣớt, giàu dinh dƣỡng N06 Đất cát, khô Đất xốp, ƣớt, giàu dinh dƣỡng N07 Đất cát, ƣớt Đất phù sa pha cát, tơi xốp N08 Đất cát, ƣớt Đất phù sa pha cát, tơi xốp N09 Đất cát, ƣớt Đất phù sa pha cát, tơi xốp N10 Đất cát, ƣớt Đất phù sa pha cát, tơi xốp N11 Đất phù sa pha cát, khô Đất thịt, tơi xốp, vàng nhạt N12 Đất phù sa pha cát, khô Đất thịt, tơi xốp, vàng nhạt N13 Đất phù sa pha cát, khô Đất thịt, tơi xốp, vàng nhạt N14 Đất phù sa pha cát, khô Đất thịt, tơi xốp, vàng nhạt
2.3.2 Dụng cụ
- Nồi khử trùng - Lequex (France). - Kính hiển vi - Olympus (Japan). - Máy ly tâm (Germany).
- Tủ cấy (America). - Pipettes 1000-2000. - Kính lúp Zeizz 3D.
- Sàng kích cỡ 50, 100, 300, 500µm. - Máy PCR.
- Máy điện di.
2.4 Phƣơng pháp
2.4.1 Lấy mẫu đất
Bƣớc 1: Gạt bỏ 3 cm đất bề mặt để loại trừ những vi sinh vật trên thảm mục thực vật.
Bƣớc 2: Dùng xẻng (đã đƣợc vô trùng bằng cồn) đào lấy phần bầu đất quanh rễ cây (ở độ sâu 3 - 20 cm) mỗi mẫu đất trồng ngô khoảng 500 gam. Đào lấy rễ và đất từ từ để hạn chế đứt phần rễ non. Mẫu đất sau khi đƣợc thu thập về phịng thí nghiệm đƣợc để khơ tự nhiên trong bóng mát, sau đó đƣợc đựng trong hộp nhựa kín, bảo quản ở nhiệt độ thấp (2-5ºC) tối thiểu 4 ngày trƣớc khi sử dụng cho phân tích hoặc ni cấy [37].
2.4.2 Phân lập AMF
AMF đƣợc phân lập bằng phƣơng pháp sàng ƣớt kết hợp với phƣơng pháp tách bào tử đơn độc với các bƣớc chính [37]:
Bƣớc 1: Trộn 100g đất cho vào 100ml nƣớc và đợi hạt nặng hơn lắng xuống trong khoảng 10 giây.
Bƣớc 2: Đổ chất lỏng qua sàng thô (500μm) để loại bỏ các phần lớn các chất hữu cơ. Thu chất lỏng đi qua sàng. Rửa sàng dƣới vòi nƣớc để tất cả các vật liệu nhỏ đã lọt qua.
Bƣớc 3: Khuấy đảo nhẹ nhàng các hạt trong chất lỏng đã đi qua sàng thô và cho phép các hạt nặng hơn lắng xuống trong vài giây.
Bƣớc 4: Tiếp tục lọc qua sàng 250μm.
Bƣớc 5: Rửa vật liệu giữ lại trên sàng để đảm bảo rằng tất cả các vật liệu có kích cỡ nhỏ hơn 250μm đã đi qua sàng.
Lưu ý: có thể sử dụng sàng có kích thƣớc khác nhau (100μm, 50μm) để sàng
và lặp lại các bƣớc nhƣ ở trên để lấy bào tử có kích thƣớc mong muốn.
Bƣớc 6: Chuyển phần vật chất dƣ lại trên sàng ở các kích cỡ khác nhau phía trên vào dung dịch đƣờng nồng độ 30-50%.
Bƣớc 7: Ly tâm từ 2-5 phút ở tốc độ 2500 vòng/phút.
Bƣớc 8: Thu phần dịch trong vào bình Dural, chuyển sang đĩa Petri và kiểm tra dƣới kính lúp Steremi D2000 (Zeizz, Đức).
Bƣớc 10: Quan sát, tách bào tử đơn độc dƣới kính hiển vi, sử dụng pipet Pasteur.
Bƣớc 11: Làm sạch bào tử.
2.4.3 Tiệt trùng các bào tử AMF
a. Cách 1:
Cho 2% cloramin vào 15ml dung dịch bào tử trong ống falcol vô trùng 50ml. Lắc dung dịch spore hai lần và để yên trong hai phút.
Ly tâm trong 3 phút ở 1750rpm.
Loại cloramin bằng pipet và hòa dung dịch bào tử lại trong dung dịch kháng sinh (1% gentamycin sµlfate + 2% streptomcyin sµlfate)
Lƣu trữ ở 4oC cho đến khi sử dụng
b. Cách 2:
Khử trùng bề mặt bằng natri hypochlorit 0,005% trong 5 phút bằng phƣơng pháp tƣơng tự nhƣ trên.
Trộn lại các bào tử trong nƣớc cất vô trùng và bảo quản ở nhiệt độ 4oC cho đến khi sử dụng [37].
2.4.4 Phân loại nấm rễ nội cộng sinh
2.4.4.1 Phân loại AMF bằng phương pháp hình thái học
Chuẩn bị dung dịch Melzer [51,52]
Bước 1: Hoà tan 1,5g KI đến 20ml nước cất
Bước 2: Hòa tan 0,5g I2 trong dung dịch từ bước 1
Bước 3: Hoà tan 20g clorrat hydrat trong dung dịch từ bước 2
Bào tử đƣợc nhuộm bằng dung dịch thuốc thử Melzer. Từng bào tử đơn độc đã đƣợc quan sát, phân tích trƣớc và sau khi nhuộm chất thử của Melzer dƣới kính hiển vi. Nhận biết bào tử dựa vào màu sắc bào tử, kích thƣớc, bề mặt và cấu trúc vách, đối chiếu các mơ tả và hình ảnh trong khóa phân loại của Bảo tàng nấm Mycorhiza Quốc tế của Đại học West Verginia (https://invam.wvu.edu/) và Schenck, Pertez, 1990 [62].
2.4.4.2 Lựa chọn các chủng nấm rễ nội cộng sinh có khả năng xâm nhiễm cao
Qua phân tích hình thái học, tiến hành lựa chọn các bào tử AMF có tần xuất bắt gặp cao nhất để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo [37]
2.4.4.3 Phân loại AMF bằng kỹ thuật sinh học phân tử a. Tách ADN
- Hút từng bào tử đơn độc vào ống eppendorf, dùng đầu côn phá vỡ bào tử. - Bổ sung 70µl đệm phá vỡ tế bào (100mM Tris-HCl (pH=8.0), 20mM Na2EDTA, 0.5 M NaCl và 1% sodium dodecylsµlfat).
- Sau đó thêm 70µl CI (hỗn hợp chloroform: isoamylacohol = 24:1); li tâm thƣờng 15000 vòng/ 5 phút. Lặp lại 2 lần bƣớc này.
- Hút ra 70µl dịch phía trên lớp huyền phù ra 1 ống eppendorf mới. Thêm 70µl isopropanol và 7µl sodium acetate 3M rồi bảo quản mẫu ở -20°C trong 2 giờ. Sau đó tiến hành li tâm lạnh 15000 vòng/15 phút để thu lấy kết tủa.
- Thêm 500µl ethanol 70%, li tâm lạnh 15000 vịng/15 phút (lặp lại bƣớc này 2 lần). Loại bỏ cồn, để khô tự nhiên.
- Thêm 50µl MQ để trong tủ -20oC dùng cho các bƣớc thí nghiệm tiếp theo.
b. Khuếch đại ADN
theo đó chúng tơi tiến hành PCR lồng (nested RCR) bằng mồi AML1 (5‟-ATC AAC TTTCGA TGG TAGGAT AGA-3‟) và AML2 (5‟-GAACCC AAA CAC TTT GGT TTC C-3‟) đặc hiệu cho AMF để nhân đoạn gen AML của chúng (Jaikoo Lee và cs, 2008). DNAr đƣợc khuếch đại trên máy GeneAmo PCR System 9700 (Appiled Biosystems), với các chu trình nhiệt nhƣ sau: đầu tiên ADN bị biến tính thành sợi đơn ở 94oC trong 3 phút, sau đó ADN đƣợc nhân đoạn ở 35 vịng, chu trình nhiệt nhƣ sau: (1) giai đoạn biến tính ADN thành sợi đơn ở 94oC trong vịng 30 giây, (2) giai đoạn bắt cặp - các cặp mồi tìm đến bắt cặp bổ sung vào 2 đầu của ADN đích: 50oC trong 60 giây, (3) cuối cùng nhiệt độ đƣợc nâng lên ở 72oC trong 1 phút nhiệt độ thích hợp cho enzyme Taq polymerase hoạt động; kết thúc nhân đoạn ADN: nâng nhiệt độ lên 72oC trong 5 phút, sau đó giảm xuống 4oC, giữ mẫu ở nhiệt độ này. Thành phần và chu kỳ của phản ứng PCR đƣợc thể hiện ở Bảng 2.2 và Bảng 2.3