* Loài 20: Racocetra gregaria
- Loài Racocetra gregaria đƣợc phân lập đƣợc ở mẫu đất tại Hà Nội.
- Đặc điểm về hình thái: Hình gần cầu, cầu, màu nâu đậm, kích thƣớc t 120-180 ì 150-220àm.
- Bào tử đƣợc nhuộm với thuốc nhuộm của Melzer:
Màu sắc: nâu đỏ, nâu đỏ đậm.
Hình dạng: gần cầu, cầu, có cuống thẳng.
Hình 3.21. Hình ảnh bào tử lồi Racocetra gregari, kích thƣớc bar 50µm
* Lồi 21: Rhizophagus clarus
- Loài Rhizophagus clarus đƣợc phân lập đƣợc ở mẫu đất tại Hà Nội và Hà
Nam.
- Đặc điểm về hình thái: Hình gần cầu, cầu, màu vàng nhạt, kích thƣớc từ 100-260µm.
- Bào tử đƣợc nhuộm với thuốc nhuộm của Melzer:
Màu sắc: vàng nhạt.
Hình dạng: gần cầu.
Vách tế bào: mỏng, nhẵn, 01 lớp tế bào, dễ vỡ.
Hình 3.22. Hình ảnh bào tử lồi Rhizophagus clarus, kích thƣớc bar 50µm
* Lồi 22: Rhizophagus sp.
- Đặc điểm về hình thái: Hình gần cầu, cầu, màu vàng nâu, kích thƣớc từ 100-240µm.
- Bào tử đƣợc nhuộm với thuốc nhuộm của Melzer:
Màu sắc: nâu vàng nhạt.
Hình dạng: gần cầu.
Vách tế bào: mỏng, nhẵn, 01 lớp tế bào, dễ vỡ.
Hình 3.23. Hình ảnh bào tử lồi Rhizophagus sp., kích thƣớc bar 50µm
* Loài 23: Septoglomus constrictum
- Loài Septoglomus constrictum đƣợc phân lập đƣợc ở mẫu đất tại Hà Nội. - Đặc điểm về hình thái: Hình gần cầu, cầu, nâu đen, kích thƣớc từ 100- 240µm
- Bào tử đƣợc nhuộm với thuốc nhuộm của Melzer:
Màu sắc: nâu đen.
Hình dạng: gần cầu.
Vách tế bào: dầy, nhẵn, 01 lớp tế bào, dễ vỡ.
Đặc biệt, trong quá trình phân lập và phân loại các lồi nấm AMF thu nhận từ đất trồng ngơ tại Hà Nội và Hà Nam, chúng tôi đã thu đƣợc 3 loài bào tử mà chƣa đƣợc cơng bố. Đây có thể là các lồi mới, cụ thể:
* Lồi 24: New Genus 1 sp.
- Loài New Genus 1sp. đƣợc phân lập đƣợc ở mẫu đất tại Hà Nam.
- Đặc điểm về hình thái: Màu nâu đen ( màu trắng đục lẫn nâu đen), hình ovan, thn dài, cầu, gần cầu, có lơng cứng, kích thƣớc t 100150 ì 190-340àm.
- Bào tử đƣợc nhuộm với thuốc nhuộm của Melzer:
Màu sắc: nâu đen, lông cứng không mất.
Hình dạng: cầu, ovan.
Vách tế bào: dầy, sần sùi, khơng vỡ
Hình 3.25. Hình ảnh bào tử lồi New Genus 1 sp., kích thƣớc bar 50µm
* Lồi 25: New Genus 2 sp.
- Loài New Genus 2 sp.đƣợc phân lập đƣợc ở mẫu đất tại Hà Nam.
- Đặc điểm về hình thái: Màu nâu đen, hình ovan, thn dài, cầu, gần cầu, xon c, kớch thc t 100-150 ì 180-240àm.
- Bào tử đƣợc nhuộm với thuốc nhuộm của Melzer:
Màu sắc: nâu sậm.
Hình dạng: cầu, ovan.
Hình 3.26. Hình ảnh của bào tử lồi New Genus 2 sp., kích thƣớc bar 50µm
* Lồi 26: New Genus 3 sp.
- Loài New Genus 3 sp. đƣợc phân lập đƣợc ở mẫu đất tại Hà Nam.
- Đặc điểm về hình thái: Hình gần cầu, cầu, khi cịn non có màu trắng, kích thƣớc từ 260-400µm.
- Bào tử đƣợc nhuộm với thuốc nhuộm của Melzer:
Màu sắc: nâu tối
Hình dạng: gần cầu, cầu,
Vách tế bào: dầy, sần sùi, dễ vỡ, 01 lớp tế bào.
Nhƣ vậy, từ 30 mẫu đất trồng ngô ở Hà Nội và Hà Nam, chúng tôi đã phân lập đƣợc 11 chi và 26 lồi AMF, trong đó ba chi chƣa phân loại đƣợc, có thể là những chi mới, cần đƣợc nghiên cứu sâu hơn.
3.3 Đánh giá đa dạng thành phần loài của AMF trong các vùng sinh thái nghiên cứu và mối tƣơng quan giữa điều kiện môi trƣờng sống tới sự đa dạng nghiên cứu và mối tƣơng quan giữa điều kiện môi trƣờng sống tới sự đa dạng thành phần loài của các chủng nấm rễ nội cộng sinh trên đất trồng ngô
3.3.1 Dựa vào thành phần loài
Sau khi phân loại các bào tử thu đƣợc bằng hình thái, chúng tơi tiến hành phân tích chi tiết về thành phần lồi theo địa điểm thu mẫu cho thấy:
- Từ 15 mẫu đất thu thập ở đất Thƣờng Tín - Hà Nội, 688 bào tử AMF đƣợc phân lập. Nấm AMF đƣợc xếp vào 8 chi, 15 loài: Acaulospora (2 loài): A. amellea,
A. rehmii; Cetraspora (1 loài): C. pellucida; Dentiscutata (2 loài): D. nigra và D.
reticulata ; Glomus (3 loài): G. ambisporum, G. multicaule, Glomus intraradices; Gigaspora (4 loài): G. albida, G. decipiens, G. gigantea, G. margarita; Racocetra (1
loài): R. gregaria; Rhizophagus (2 loài): R. clarus, Rhizophagus sp; Septoglomus (01 loài): S. constrictum.
- Từ 15 mẫu đất thu thập ở đất tại Duy Tiên - Hà Nam, 2486 bào tử nấm AMF đƣợc phân lập. Phân tích hình thái học cho thấy, chúng thuộc 8 chi, 18 loài:
Acaulospora (7 loài): A. gerdemanii, A. longula; A. morrowiae, A. rehmii, Acaulospora sp.1, Acaulospora sp.2, Acaulospora sp.3, Dentiscutata (2 loài): D. reticulata, Dentiscutata sp.; Glomus (1 loài): G.intraradices; Gigaspora (3 loài): G. decipiens, G. gigantea, G. margarita; Rhizophagus (2 loài): R. clarus, Rhizophagus sp.
Đặc biệt có 3 chi có hình thái bào tử khác với các chi/lồi đã biết - chúng đƣợc cho rằng có thể đây sẽ là những đơn vị phân loại AMF mới, hình dạng bào tử khơng giống với các mơ tả về AMF trƣớc đó. Cụ thể:
- Chi thứ nhất - New genus 1: Bào tử khi cịn ngun có hình cầu, gần cầu, có lơng cứng. Lơng cứng, khơng bị rụng trong khi làm tiêu bản, có hình cầu, hình
- Chi thứ hai - New genus 2: Bào tử khi cịn ngun có hình xoắn ốc trên bề mặt, hình ovan, thn dài, cầu, gần cầu, xoắn ốc. Khi phá vỡ bào tử và nhuộm thuốc nhuộm, bào tử có màu nâu sậm, hình cầu, ovan, vách tế bào: dầy, sần sùi, dễ vỡ, tạo rãnh xoắn ốc trên bề mặt.
- Chi thứ 3 - New genus 3: Bào tử khi cịn ngun có màu trắng, khi nhuộm thuốc nhuộm bắt màu nâu tối.
Tuy nhiên, để đƣa ra những nhận định về loài mới, chi mới cần có thêm những thơng tin và thêm các phƣơng pháp nghiên cứu đáng giá chính xác hơn để có thể đƣa ra những kết luận về những vấn đề này.
So sánh với các nghiên cứu trƣớc, có thể nhận thấy rằng sự đa dạng nấm rễ nội cộng sinh trên rễ cây ngô cao hơn so với một số loại cây lƣơng thực khác (lúa, cà chua) ở Việt Nam. So với nghiên cứu năm 2012 của Trần Thị Nhƣ Hằng và cộng sự về sự đa dạng của AMF trên rễ cây lúa và cây cà chua, các tác giả chỉ phát hiện đƣợc 5 chi: Scutellospora, Glomus, Acaulospora, Gigaspora, và Entrophospora [8]. Hay trong một nghiên cứu về đa dạng AMF trên rễ cây cam ở
Quỳ Hợp, Nghệ An, từ 60 mẫu đất, các tác giả cũng chỉ phát hiện đƣợc chỉ có 6 chi: Acaulospora, Entrophospora, Glomus, Sclerocystis, Glomites and Gigaspora, 16 loài [9]. Tuy nhiên, so với cá nghiên cứu khác trên thế giới thì có sự tƣơng đồng: Zhang và cs 2003 đã tìm đƣợc 47 lồi AMF từ đất khơ hạn hay Wang và cộng sự (2008) đã tìm đƣợc 33 lồi AMF từ đất ngập mặn, Zhao và cộng sự (2003) tìm đƣợc 5 chi, 27 lồi AMF từ rừng mƣa nhiệt đới Xishangbanna...[79, 80].
3.3.2 Dựa vào tần suất xuất hiện
Sau khi đƣợc phân loại bằng hình thái, các bào tử AMF đƣợc tiến hành đánh giá thêm sự đa dạng thành phần loài bằng cách dựa trên tần suất xuất hiện các chi, loài. Kết quả chi tiết thể hiện tại Bảng 3.2, Bảng 3.3, Hình 3.28 và Hình 3.29.
Bảng 3.2. Tần suất xuất hiện của các chi AMF
STT Tên chi Số lần xuất hiện Tần suất xuất hiện Hà Nội Hà Nam Hà Nội Hà Nam
1 Acaulospora 13,00 44,00 12,4 37,6 2 Cetraspora 6 0 5,7 0,0 3 Dentiscutata 15 15 14,3 12,8 4 Glomus 20 5 19,0 4,3 5 Gigaspora 34 35 32,4 29,9 6 Racocetra 2 0 1,9 0,0 7 Rhizophagus 8 9 7,6 7,7 8 Septoglomus 7 0 6,7 0,0 9 New Genus 1 0 2 0,0 1,7 10 New Genus 2 0 5 0,0 4,3 11 New Genus 3 0 2 0,0 1,7 105,00 117,00 100,00 100,00
Nhận xét: Qua bảng 3.2 và hình 3.28 cho thấy: Đa dạng của các lồi AMF trong đất trồng ngô ở Hà Nội đƣợc chia vào 8 chi: Acaulospora; Cetraspora; Dentiscutata; Gigaspora; Glomus; Racocetra; Septoglomus. Trong số đó, Dentiscutata, Racocetra, Rhizophagus và Septoglomus lần đầu tiên công bố tại Việt Nam. Các chi Acaulospora; Dentiscutata; Gigaspora; Glomus là những chi chiếm ƣu thế với tần suất xuất hiện lần lƣợt là 12,40 %; 14,3 %; 32,4 % và 19,0 %. Tại đất trồng ngô ở Hà Nam cũng ghi nhận nhiều sự khác biệt, 8 chi đƣợc tìm thấy ở các mẫu này là Acaulospora; Dentiscutata; Glomus; Gigaspora; Rhizophagus và 3 chi New Genus 1, New Genus 2, New Genus 3.
Trong đó, Acaulospora, Dentiscutata, Gigaspora là những chi chiếm ƣu thế
tần suất xuất hiện lần lƣợt là: 37,6 % và 29,9% (Bảng 3.2 và Hình 3.28). Đặc biệt có 3 chi đƣợc cho là mới phát hiện đƣợc gồm có New Genus 1, New Genus 2, New Genus 3. Tuy nhiên, để đƣa ra những nhận định về lồi mới, chi mới cần có thêm những thơng tin và thêm các phƣơng pháp nghiên cứu đáng giá chính xác hơn để có thể đƣa ra những kết luận về những vấn đề này.
Bảng 3.3. Tần suất xuất hiện của các loài AMF
STT Tên loài Số lần xuất hiện Tần suất xuất hiện
Hà Nội Hà Nam Hà Nội Hà Nam
1 A. gerdemanii 0 9 0 7,69 2 A. longula 0 5 0 4,27 3 A.mellea 11 0 10,5 0,00 4 A.morrowiae 0 5 0 4,27 5 A.rehmii 2 7 1,9 5,98 6 Acaulospora sp.1 0 6 0 5,13 7 Acaulospora sp.2 0 5 0 4,27 8 Acaulospora sp.3 0 7 0 5,98 9 C.pellucida 6 0 5,7 0,00 10 D.nigra 6 0 5,7 0,00 11 D.reticulata 9 5 8,6 4,27 12 Dentiscutata sp. 0 10 0,0 8,55 13 G. ambisporum 2 0 1,9 0,00 14 G. multicaule 11 0 10,5 0,00 15 G. intraradices 7 5 6,7 4,27 16 G. albida 3 0 2,9 0,00 17 G.decipiens 15 15 14,3 12,82 18 G. gigantea 13 15 12,4 12,82 19 G.margarita 3 5 2,9 4,27 20 R. gregaria 2 0 1,9 0,00 21 R.clarus 4 5 3,8 4,27 22 Rhizophagus sp. 4 4 3,8 3,42 23 S.constrictum 7 0 6,7 0,00 24 New Genus 1 0 2 0 1,71 25 New Genus 2 0 5 0 4,27 26 New Genus 3 0 2 0 1,71 105 117 100 100
Hình 3.29. Biểu đồ tần suất xuất hiện của các loài AMF
Nhận xét: Qua bảng 3.3 và hình 3.29 cho thấy tại những mẫu đất trồng ngơ ở Hà Nội đã có 16 lồi đƣợc phát hiện, trong số đó có 4 lồi Gigaspora decipiens, Gigaspora gigantean, Glomus multicaule và Acaulospora mellea là những loài chiếm ƣu thế, tần suất xuất hiện lần lƣợt là: 14,3 %; 12,4 %; 10,5 % và 10,5 %. Còn tại đất trồng ngô Hà Nam, phát hiện đƣợc 18 lồi, trong đó 2 lồi Gigaspora decipiens và Gigaspora gigantean là những loài chiếm ƣu thế, tần suất xuất hiện lần
lƣợt là: 18,8 % và 12,8% (Bảng 3.3 và Hình 3.29).
Nhƣ vậy, có thể thấy các lồi thuộc chi Acaulospora, Gigaspora và Glomus là những loài AMF chiếm ƣu thế. Kết qủa phân tích về đa dạng của AMF này khá tƣơng đồng so với các nghiên cứu trƣớc đó của Trần Thị Nhƣ Hằng và cs (2012) và Nguyễn Thị Kim Liên và cs (2012) cho rằng đây là những chi thƣờng gặp trong đất trồng cà chua, mía và cam ở Việt Nam [5,7].
3.3.3 Dựa vào mật độ loài
Để đánh giá đƣợc mức độ đa dạng của AMF trong đất trồng ngô, trong nghiên cứu này chúng tơi cịn đề cập đến đa dạng mật độ lồi của AMF trên đất trồng ngô Hà Nội và Hà Nam. Kết quả đƣợc trình bày trên Bảng 3.4 và Hình 3.30
Bảng 3.4. Sự phân bố của AMF trong đất theo mật độ loài (SR)
STT Mẫu
Loài AMF xuất hiện Giá trị SR
Hà Nội Hà Nam Nội Hà Nam Hà
1 N01 1 10 6 7 10 12 13 20 21 22 25 26 2 10 2 N02 3 18 6 7 13 20 21 22 26 2 7 3 N03 3 9 16 13 4 6 7 10 12 13 15 17 19 20 21 22 24 25 26 4 15 4 N04 1 9 11 12 4 10 12 13 14 19 20 21 22 26 4 10 5 N05 1 5 9 11 4 7 12 13 14 20 21 22 24 4 9 6 N06 17 13 14 21 2 3 4 6 7 10 12 13 14 17 5 10 7 N07 3 11 20 13 2 3 6 7 10 12 13 14 17 24 4 10 8 N08 1 10 11 17 18 19 23 6 7 10 13 26 14 17 7 7 9 N09 1 11 17 18 21 2 4 6 12 13 19 26 5 7 10 N10 3 9 10 20 2 3 4 6 13 14 26 4 7 11 N11 3 16 14 2 6 7 12 13 14 3 6 12 N12 10 17 23 2 3 4 6 7 12 13 17 26 3 9 13 N13 21 23 2 3 6 7 10 12 13 24 26 2 9 14 N14 9 14 23 2 4 6 7 12 13 14 26 3 8 15 N15 17 23 2 12 13 14 17 19 26 2 7
Hình 3.30. Biểu đồ mật độ lồi AMF
Nhận xét: Sự phân bố về mật độ bào tử (SD) và mật độ loài (RS) của 15 loài AMF trong 15 mẫu đất trồng ngô Hà Nội thể hiện trong bảng 2 cho thấy mật độ bào tử AMF trên mỗi mẫu từ 9,5-102 bào tử/100g đất (trung bình là 45.63 bào tử/100g). Mật độ loài cũng thay đổi từ 1-7 lồi/mẫu (trung bình là 3,6 lồi).
Trong khi đó sự phân bố về mật độ bào tử (SD) và mật độ loài (RS) của 18 loài AMF trong 15 mẫu đất trồng ngô Hà Nam thể hiện trong bảng 2 cho thấy mật độ bào tử AMF trên mỗi mẫu từ 110-304 bào tử/100g đất (trung bình là 165.72 bào tử/100g). Mật độ loài cũng thay đổi từ 6-15 lồi/mẫu (trung bình là 8,73 lồi).
Kết quả cũng cho thấy có sự tƣơng quan giữa mật độ bào tử và số lƣợng loài xuất hiện trong cùng một mẫu. Các mẫu có số lƣợng bào tử nhiều thì đồng thời số lƣợng lồi nấm ở mẫu đất đó cũng lớn. Kết quả này tƣơng đồng với nghiên cứu của Zhao và cộng sự (2003) nghiên cứu sự đa dạng của AMF trong rừng mƣa nhiệt đới của Xishuangbanna [80].
3.4 Lựa chọn một số AMF có độ đa dạng cao để phân loại chúng bằng kỹ thuật sinh học phân tử thuật sinh học phân tử
Trong số 11 chi AMF đƣợc phát hiện từ hai địa điểm nghiên cứu,
cứu, lần lƣợt là 12,4% và 32,4% tại Hà Nội và 37,6% và 29,9% tại Hà Nam. Các chủng 03 chủng SP2, SP18, và SP19 là các chủng thuộc chi Acaulospora và
Gingaspora dựa vào phân tích hình thái học. Chúng đƣợc lựa chọn tiến hành phân
tích bằng phƣơng pháp sinh học phân tử vào phân tích trình tự gen ARN 18S đoạn AML1/AML2. Kết quả đƣợc trình bày dƣới đây:
Hình 3.31. Cây chủng loại phát sinh của các chủng AMF nghiên cứu và các lồi có mối quan hệ họ hàng gần dựa vào phân tích trình tự 18S.
Giá trị Bootstrap value > 50% đƣợc thể hiện trên cây. Bar 0.01
Phân tích trình tự gen dựa vào phân tích trình tự đoạn 18S của SP2 nằm trên cùng một nhánh với Acaulospora V3 và Acaulospora longula với giá trị bootstrap
57-74%. Nhƣ vậy có thể thấy rằng có sự phù hợp giữa phân loại dựa vào phân tích hình thái và phân tích trình tự 18S của chủng SP2 thuộc về loài Acaulospora longula. Kết quả này phù hợp với kết quả phân tích hình thái học.
Paraglomus_occultum_KP144314.1 Diversispora_epigaea X86687
SP19 SP18
Gigaspora margarita AJ852604
100 Acaulospora_brasilien FN825899 Acaulospora_longula AJ306439 Acaulospora V3 KC182581 SP2 74 Acaulospora_lacunosa FR719957 Acaulospora mellea FJ009670.1 57 94 Acaulospora_cavernata AJ306442 Acaulospora laevis Y17633 Acaulospora_spinos Z14004 81 64 74 72 52 63 52 Glomus_macrocarpum_FR772325.1 Funneliformis_mosseae_FR750227 Glomus_intraradices_FJ009604 91 94 0.01
Phân tích chủng loại phát sinh cịn cho thấy SP18, SP19 có họ hàng gần gũi với nhau và với Gingaspora marganita. SP18 và SP19 nằm trên cùng nhánh nhỏ
với giá trị Bootstrap 100%; nhánh nhỏ này nằm trên cùng cụm với G. marganita,
giá trị bootstrap là 52%. Có thể kết luận rằng SP18, SP19 thuộc về Gingaspora marganita và loài gần gũi với chúng. Dựa vào kết quả phân tích hình thái và phân
tích sinh học phân tử có thể kết luận SP19 thuộc về lồi G. gigantea cịn SP18 thuộc về lồi G. margarita.