1.9.1. Bột bã sắn
Hiện nay, sắn được trồng trên 100 nước của vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và là nguồn thực phẩm của hơn 500 triệu người. Năm 2006 và 2007, sản lượng sắn thế giới đạt 226,34 triệu tấn củ tươi so với 2005/06 là 211,26 triệu tấn và 1961 là 71,26 triệu tấn. Nước có sản lượng sắn nhiều nhất là Nigeria (45,72 triệu tấn), kế đến là Thái Lan (22,58 triệu tấn) và Indonesia (19,92 triệu tấn). Nước có năng suất sắn cao nhất là Ấn Độ (31,43 tấn/ha), kế đến là Thái Lan (21,09 tấn/ha), so với năng suất sắn bình quân của thế giới là 12,16 tấn/ha (FAO, 2008). Việt Nam đứng thứ mười về sản lượng
sắn (7,71 triệu tấn) trên thế giới. Tại Việt Nam, sắn được canh tác phổ biến ở hầu hết các tỉnh của tám vùng sinh thái. Diện tích sắn trồng nhiều nhất ở Đơng Nam Bộ và Tây Nguyên [1].
Củ sắn tươi có tỷ lệ chất khơ 38-40%, tinh bột 16-32%; protein, chất béo, xơ, tro trong 100g được tương ứng là 0,8-2,5 g, 0,2-0,3 g, 1,1-1,7 g, 0,6-0,9 g; chất muối khoáng và vitamin trong 100 g củ sắn là 18,8-22,5 mg Ca, 22,5-25,4 mg P, 0,02 mg B1, 0,02 mg B2, 0,5 mg PP. Thành phần dinh dưỡng khác biệt tuỳ giống, vụ trồng, số tháng thu hoạch sau khi trồng và kỹ thuật phân tích [85].
Sắn có nhiều cơng dụng trong chế biến cơng nghiệp, thức ăn gia súc và lương thực thực phẩm. Củ sắn dùng để ăn tươi, làm thức ăn gia súc, chế biến sắn lát khô, bột sắn nghiền, tinh bột sắn, tinh bột sắn biến tính, các sản phẩm từ tinh bột sắn như bột ngọt, cồn, maltodextrin, lysine, acid citric, xiro glucose và đường glucose tinh thể, mạch nha giàu maltose, hồ vải, hồ giấy, colender, phủ giấy, bìa các tơng, bánh kẹo, mì ăn liền, bún, miến, mì ống, mì sợi, bột khoai, bánh tráng, hạt trân châu (tapioca), phụ gia thực phẩm, phụ gia dược phẩm, sản xuất màng phủ sinh học, chất giữ ẩm[1].
1.9.2. Bỗng rượu
Ở nước ta,nhiều địa phương có truyền thống nấu rượu. Việc nấu rượu theo cách thức cổ truyền đã tạo ra nguồn bỗng rượu phong phú. Đây là phụ phẩm được tạo ra từ quá trình chưng cất rượu sau khi lên men vi sinh vật và là một loại phụ phẩm rẻ tiền, sẵn có ở nơng hộ và có quanh năm, đồng thời các nghiên cứu cũng cho thấy bỗng rượu là một trong những nguồn phế phẩm nơng nghiệp có chứa hàm lượng dinh dưỡng cao. Từ xa xưa bỗng rưỡu đã được tận dụng làm thức ăn chăn nuôi và đã đem lại hiệu quả chăn nuôi cao [11].
Một vài nghiên cứu trong những năm gần đây đã cơng nhận bỗng rượu có thể được coi như là một nguồn cơ chất phù hợp để sản xuất khí biogas, thành phần khí biogas thu được từ bỗng rượu chứa khoảng 55-65% khí mê-tan, 30-45% carbon
dioxide, có sự xuất hiện của hydro. Sản lượng khí biogas thu được là 3476 cm3 / 100 g bỗng rượu sau 15 ngày. Tiềm năng lý thuyết của sản xuất khí mê-tan trên một tấn bỗng rượu ước tính là 98 Nm3 khí mê-tan [79].
Hình 1.4 cho thấy con đường lên men sản xuất hydro từ bỗng rượu bắt đầu từ sự lên men các axit béo của quá trình thủy phân tinh bột thành alcohol, do vậy bỗng rượu hồn tồn có thể trở thành một trong những nguồn cơ chất sản xuất hydro sinh học trong tương lai [15].
Hình 1.4: Sơ đồ phản ứng phân giải các hợp chất hữu cơ trong quá trình lên men rƣợu [15]
Độ pH bỗng rượu ở mức thấp và biến động từ 3,05-3,36. Protein và năng lượng của bỗng rượu đạt ở mức cao (28,18% và 4.866,67 kcal/kg DM– hàm lượng chất khơ tồn phần. Tỷ lệ NDF ( hàm lượng chất xơ trung tính) trung bình đạt ở mức cao 29,93% theo DM. Tỷ lệ axit lactic của bỗng rượu ở mức cao (2,31 g/100g chất tươi) và hàm lượng axit tổng số đạt trung bình là 17,39 g/kg chất tươi. Hàm lượng Ca, P của
bỗng rượu là thấp, biến động từ 0,1 đến 0,32% và 0,3 đến 0,96% DM. Kết quả về thành phần hóa học một số chỉ tiêu của bã rượu trong nghiên cứu này (DM, protein, khống tổng số, NDF, năng lượng thơ) tương đối cao (9,10%; 23,10%; 4,7%; 15,40%; 4.777 kcal/kg, tương ứng), và một số chỉ tiêu lipit, canxi, phospho tương ứng là 9,90%; 0,55%, 0,35% DM. Sự khác nhau này có thể do loại gạo, men, dụng cụ, phương pháp chưng cất rượu [6]
Với những giá trị dinh dưỡng và lợi ích về mặt kinh tế bỗng rượu là một nguồn nguyên liệu đầu vào thích hợp cho việc sản xuất hydro sinh học với giá thành rất rẻ, có thể lên men sản xuất trên quy mô công nghiệp bởi đây là nguồn nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm.
CHƢƠNG 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. Nguyên liệu và thiết bị
2.1.1. Nguyên liệu
- Mẫu dạ dày bò được lấy tại lò giết mổ tư nhân tại huyện Quốc Oai, Thành phố Hà Nội.
- Mẫu được lấy ngay sau khi giết mổ và bảo quản lạnh.
- Chủng Clostridium beijerinckii NBRC109359 được mua tại Ngân hàng gen của NITE Nhật Bản.
2.1.2. Thiết bị
- Bể lắc ổn nhiệt (water shaking bath; Model: WSB – 30; Serial no: 0398272117PO10; Hàn Quốc).
- Máy sắc kí khí (Gas Chromatography – GC; 7890A; serial #: us11501033 - USA) để đo lượng khí H2 sinh ra. Máy soi và chụp ảnh gel GelDoc (BioRad, Mỹ).
- Bình khí N2 pure và dây dẫn khí để tạo mơi trường kị khí (Model: Tornado LS/B – He; Vietnam).
- Cân điện tử để xác định trọng lượng các thành phần của môi trường (Model: precisa 310M; Thụy Sỹ).
- Máy ly tâm lạnh (Eppendorf, Đức); máy PCR (Mastercycler, Eppendorf, Đức), hệ thống điện di gel agarose (NixTechnik, Pháp); Kính hiển vi quang học Olimpus (Nhật).
- Box cấy kị khí (Model: Whitley VA 500 workstation, Anh), tủ ổn nhiệt (Imperial III).
- Máy đo OD để xác định khả năng sinh trưởng của vi sinh vật (Model: Biomate 3; serial no: 2KBK 138001; Mỹ).
2.1.3. Dụng cụ
- Bình serum 15 mL, 100 mL, nắp cao su và nắp nhơm, kim tiêm để ni cấy kị khí. Gas-tight syringe (P/N 008160; 1MR-VLL-GT; C04-A1831 –Australia) để lấy mẫu khí cho GC, dụng cụ kẹp nắp nhôm (Handy crimper for aluminum seal), pipet, đầu cơn, đĩa petri, ống eppendorf, ống falcol, bình tam giác, ống đong, ống nghiệm…
2.2. Môi trƣờng
Trong nghiên cứu này, môi trường nuôi cấy được chuẩn bị cho phương pháp lên men theo mẻ (batch fermentation) dưới điều kiện kị khí [93].
- Danh mục hóa chất, xuất xứ Pepton: Merck Glucose: Merck KH2PO4: Merck NaHCO3: Merck K2HPO4: Merck Reazurin: Sigma Và một số hóa chất thơng dụng khác
Cao nấm men: Merck NaCl: Merck CaCl2.6H2O: Merck MgSO4: Merck Agar : Merck DNS : Trung Quốc 2.2.1. Môi trường PY (1000mL)
Sử dụng để làm giàu và phân lập vi khuẩn sinh hydro
Peptone: 10 g Yeast extract: 10 g Glucose: 10 g Reazurine: 1mg Salt solution: 40 mL H2O 960 mL ;pH = 5,0
100 mL salt solution gồm: KH2PO4: 0,1 g K2HPO4: 0,1 g NaHCO3: 1 g NaCl: 0,2 g CaCl2: 0,02 g MgSO4: 0,02 g pH = 6,5
Sau khi pha môi trường xong, pH môi trường sẽ được điều chỉnh về 7,0 bằng NaOH 1%. Cho mơi trường vào bình serum, khử trùng ở 121°C, 1atm, thời gian 20 phút sử dụng nồi hấp.
2.2.2. Môi trường PYA
Được bổ sung thêm 16g/L agar vào môi trường PY khử trùng ở 121°C, 1atm, thời gian 20 phút sử dụng nồi hấp phục vụ cho phân lập vi khuẩn trên đĩa Petri.
2.2.3. Môi trường PYG (1000 mL)
Glucose 10g Peptone 3g Cao nấm men 1g Na2HPO4.12H2O 21,5g KH2PO4,2H2O 8,1g MgCl2.6H2O 0,1g FeSO4.7H2O 0,2g L-cysteine 0,1g
Dung dịch muối khoáng 10mL Dung dịch vitamin 10mL
1000mL dung dịch muối khoáng gồm: MnSO4.7H2O 0,001g ZnSO4.7H2O 0,05g H3BO3 0,01g CaCl2.2H2O 0,01g Na2MoO4 0,01g CoCl2.6H2O 0,2g Alk(SO4)2.12H2O 0,01g NiCl.6H2O 0,001g N[(CH2)COO]3 2,0g 1000mL dung dịch vitamin gồm Cobalamin 0,01g Vitamin C 0,025g Riboflavin ( Vitamin B2) 0,025g Citric acid 0,02g Pyridoxal (Vitamin B6) 0,05g Folic acid 0,01g Creatine 0,025g p-aminobenzoic acid 0,01g
Sau khi pha môi trường xong, pH môi trường sẽ được điều chỉnh về 6.5 bằng NaOH 1%. Cho mơi trường vào bình serum, khử trùng ở 121°C, 1atm, thời gian 20 phút sử dụng nồi hấp.
2.2.4. Môi trường với nguồn cơ chất là bột bã sắn
- Nguyên liệu: Trong nghiên cứu này bột bã sắn được lấy tại nhà máy xay xát
bột tại huyện Quốc Oai, Thành phố Hà Nội. Bột bã sắn dạng này là phế phẩm nông nghiệp được chế biến thủ công từ 2 đầu vứt đi của củ sắn phơi khơ, sau đó đem nghiền thành bột làm thức ăn cho gia súc.
- Phƣơng pháp tiền xử lí bột sắn: .
Bột bã sắn khi mang về sẽ được pha lỗng với nước cất ở tỉ lệ 1:4 (w/w),sau
đó xử lí nhiệt 90oC trong 15 phút để làm tăng hàm lượng carbohydrate hòa tan
Trộn đều bằng máy xay trong khoảng 1 phút.
- Pha môi trƣờng: Bột bã sắn được thay thế cho nguồn carbon là glucose trong
môi trường PY. Môi trường được điều chỉnh pH về 6.5 – 7.0 cho vào các bình serum, khử trùng ở 121°C trong 15 phút, sử dụng nồi hấp khử trùng..
2.2.5. Môi trường với nguồn cơ chất là bỗng rượu
- Nguyên liệu: bỗng rượu được lấy tại cơ sở sản xuất rượu nếp tư nhân tại
huyện Quốc Oai, Thành phố Hà Nội
- Phƣơng pháp xử lý bỗng rƣợu: bỗng rượu là sản phẩm trong giai đoạn lên
men gạo cuối cùng để tạo thành rượu nên mơi trường có tính axit cao, pH từ 2.0 đến 3.0. Do đó cần phải điều chỉnh pH về mức 6.5 – 7.0 bằng NaOH 10M. Cho mơi trường vào bình serum, khử trùng ở 121°C trong 15 phút sử dụng nồi hấp khử trùng.
2.2.6. Các môi trường khác
Môi trƣờng Indole cho thử nghiệm Indole (g/L)
Pepton 1
pH 7,2-7,6
Môi trƣờng cho thử nghiệm Urease (g/L)
Pepton 1 NaCl 5 Glucose 1 KH2PO4 2 Dung dịch đỏphenol 0,2% 2 mL Agar 20 pH 6,8 – 6,9
Môi trƣờng cho thử nghiệm VP (g/L)
Pepton 7
NaCl 5
Glucose 5
Môi trƣờng cho thử nghiệm MR (g/L)
Pepton 5
NaCl 5
Glucose 5
pH 7,0 – 7,2
Môi trƣờng cho thử nghiệm Citrate (Simmons citrate agar) - g/L
Sodium citrate 2 NaCl 5 MgSO4 0,2 NH4H2PO4 1 K2HPO4 1 Brommthymol blue 0,08 Agar 18
Môi trƣờng thủy phân gelatimase (g/L)
Pepton 5
Gelatin 100 - 150
pH 7,2 – 7,4
Môi trƣờng cho thử nghiệm catalase
H2O2 1 mL
Môi trƣờng Indole cho thử nghiệm Lipase - g/L
Pepton 10
NaCl 5
CaCl2.2H2O 0,1
pH 7,4
Môi trƣờng thử hoạt tính Lecithinase
Lịng đỏ trứng 5 mL/L
NaCl (0.9%) 5 mL/L
Pepton 10 g/L
Agar 16 g/L
Mơi trƣờng thử hoạt tính enzyme amylase - g/L
Agar 15
Tinh bột tan 1
pH 7
Mơi trƣờng thử hoạt tính phân giải cellulose
Agar 15 g/L
CMC 1 g/L
Mơi trƣờng thử hoạt tính phân giải protein
Agar 15 g/L
Casein 1 g/L
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh hydro
2.3.1. Phương pháp xử lý mẫu và nuôi cấy
- Các mẫu thu thập được pha loãng trong nước cất, tiền xử lý mẫu bằng máy gia nhiệt ở 1000 C trong 30 phút [28].
- 8mL môi trường sẽ được cho vào bình serum 15mL sau đó được đóng nắp cao su và nắp nhơm bên ngồi.
- Headspace của bình serum được sục khí N2 tinh khiết để loại bỏ hết O2 trong bình nhằm tạo mơi trường kị khí. Khi mơi trường trở lên trong suốt và lắc lên khơng
• Thu mẫu dạ dày bị tại Huyện Quốc Oai, Tp. Hà Nội
Thu mẫu
• Ni cấy mẫu trong bình serum, xác định lượng hydro sinh ra từ mỗi mẫu, chọn các mẫu cho sản lượng hydro cao (ml/L môi trường)
Làm giàu và thử sinh hydro
• Phân lập các vi sinh vật kị khí sinh hydro trong mẫu được chọn và định danh bằng khóa định loại Bergey kết hợp kĩ thuật sinh học phân tử Phân lập và định danh
• So sánh sản lượng hydro của các chủng phân lập được với một số chủng Clostridium khác
So sánh sản lượng hydro
• Khảo sát khả năng sinh hydro trên một số nguồn cơ chất được thực hiện với mơ hình lên men đơn chủng và lên men kết hợp
Khảo sát khả năng sinh hydro trên một số nguồn cơ
chất có sẵn
• Sử dụng phần mềm DX7.1.5 và mơ hình thí nghiệm của Box-Behnken để tối ưu hóa điều kiện lên men làm tăng sản lượng hydro
Tối ưu hóa điều kiện lên men bằng phương pháp đáp
ứng bề mặt
• Nghiên cứu khả năng sinh khí hydro khi lên men với nguồn cơ chất là bột bã sắn và bỗng rượu.
Khả sát khả năng sinh khí hydro trên một số nguồn cơ
còn thấy hiện tượng chuyển sang màu hồng của thuốc thử thì mơi trường đã sẵn sàng cho việc làm giàu chủng.
Hình 2.2: Phƣơng pháp sục khí nitơ
- Cấy giống từ 5-10% (v/v) khi vẫn đang tiến hành sục khí N2.
- Cuối cùng cho bình serum đã cấy vào bể lắc ổn nhiệt và nuôi cấy ở 37oC, 200 rpm.
- Sau 2 ngày ni cấy chọn những mẫu có khả năng sinh khí hydro cao cấy chuyển sang bình làm giàu lần thứ hai và thứ ba để phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo.
- Lấy dịch nuôi cấy lần thứ 3 pha lỗng, cấy trải trên đĩa thạch mơi trường PYA, PYGA trong tủ ni cấy kị khí.
- Sau 24- 48 giờ, quan sát và lựa chọn những khuẩn lạc to, riêng rẽ nuôi lại kiểm tra khả năng sinh H2.
- Từ các đĩa Petri chọn ra các khuẩn lạc riêng rẽ dựa vào đặc điểm khác nhau về hình dáng, kích thước, màu sắc, bề mặt, mép, độ lồi. Sau đó chúng tơi đã ni thuần chủng tinh khiết và giữ giống phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo.
Các chủng thuần khiết phân lập được sẽ được thử nghiệm về hình thái, tính chất sinh lý, sinh hóa. Mặc dù phương pháp này khơng hồn tồn chính xác nhưng đây là bước đầu tiên trong nghiên cứu phân loại vi sinh vật. Các thí nghiệm được thực hiện như sau [3]:
2.3.2. Định danh vi khuẩn theo khóa định loại Bergey [3,4,64]
Định danh theo khóa định loại Bergey là phương pháp định danh dựa vào một số đặc điểm hình thái và một số đặc tính sinh lý, sinh hóa đặc trưng của vi sinh vật. Một số các đặc điểm đặc trưng để phân loại theo khóa Bergey là:
Nhuộm Gram
Khả năng sinh bào tử
Thử nghiệm Catalase [3, 4]
Thử nghiệm khả năng di động
Thủy phân gelatin
Thử nghiệm Indole
Thử nghiệm hoạt tính Lecithinase
Thử nghiệm Urease
Đồng hóa Citrate
Thử nghiệm Oxidase
Thử nghiệm Methyl red (MR)
Thử nghiệm VP
2.3.3. Định danh chủng sinh khí hydro dựa vào giải trình tự đoạn gen 16S rRNA
Tách chiết và tinh sạch DNA
Tách chiết và tinh sạch DNA sử dụng bộ kit “Magpure Bacteria DNA Kit” của ANABIO Research & Development. Kiểm tra chất lượng DNA là bước cần thiết trong
quy trình tách chiết DNA, DNA tinh sạch được phân tích bằng cách điện di trên gel agarose 1%, nhuộm bởi EtBr và được quan sát bằng ánh sáng UV.
PCR khuếch đại đoạn 16S rDNA
Sau khi tinh sạch genome, đoạn gen mã hóa 16S rRNA được khuếch đại bằng cặp mồi 27F và 1527R. 27F 1527R 5’-AGAGTTTGATAMTGGCTCAG-3’ 5’-AAAGGAGGTGATCCAGCC-3’ Thành phần PCR (tổng thể tích 30µl/phản ứng): 10x buffer: ADN mẫu (100- 200 ng/µl: 27Fw (10 pmol): 1527Rv (10 pmol): dNTP: H2O: 3 µl 4 µl 1,5 µl 1,5 µl 3 µl 16,3 µl
Chu trình nhiệt cho PCR:
94°C 5 phút 94°C 30 giây 62°C 45 giây 72°C 90 giây 72°C 5 phút 4°C ∞
Sản phẩm sau PCR được điện di kiểm tra bằng gel agarrose 1%, so sánh với DNA laSTer 1kb, nhuộm bởi EtBr và được quan sát bằng ánh sáng UV.
Tinh sạch sản phẩm PCR:
Sản phẩm PCR được tinh sạch theo bộ kit “Anapure PCR product” của ANABIO R & D. Sản phẩm PCR tinh sạch được điện di kiểm tra bằng gel agarose 1%,
nhuộm bởi EtBr và quan sát bằng ánh sáng UV. Băng có kích thước khoảng 1500bp là sản phẩm tương ứng với vùng trình tự của rDNA ở vi khuẩn.
Giải trình tự sản phẩm PCR và phân tích dữ liệu:
Các mẫu DNA tinh sạch từ sản phẩm PCR được giải trình tự. Các trình tự DNA sau đó được phân tích bằng phần mềm Chromas và DNA club, sau đó so sánh với dữ