dày bị
Lên men sản xuất hydro có thể được tiến hành với hỗn hợp các chủng vi sinh vật hoặc đơn chủng. Tuy nhiên, trong hệ vi sinh vật đa dạng của dạ cỏ bị khơng chỉ chứa các vi sinh vật sinh hydro mà còn bao gồm cả những vi sinh vật tiêu thụ hydro và những vi sinh vật lên men sinh ra các axit béo dễ bay hơi khác như axit acetic, axit butyric,.... điều này khiến cho việc thu hồi và làm sạch khí hydro gặp nhiều khó khăn, đồng thời cũng gây khó khăn trong q trình nghiên cứu để tối ưu hóa sản lượng hydro sinh ra. Do đó, việc tiến hành chọn lọc các chủng vi sinh vật sinh hydro là cần thiết để tối ưu hóa sản lượng hydro thu được.
Tiến hành lên men vi sinh vật ở 37°C trong 48h đối với những khuẩn lạc có hình dạng khác nhau, sau đó quan sát bình serum để xác định khả năng sinh khí biogas:
Phần đáy bình có những bọt khí nhỏ chứng tỏ có khí sinh ra.
- Quan sát nắp cao su thấy nắp cao su cứng và phồng lên chứng tỏ có khí sinh ra.
- Mơi trường ni cấy đục màu và sau khi để lắng khoảng 30 phút thấy đáy bình có cặn màu trắng chứng tỏ đã có sự phát triển của vi sinh vật một cách mạnh mẽ.
- Dựa vào kết quả đo lượng khí hydro bằng máy GC xác định % khí hydro sinh ra của chủng sinh khí.
Kết quả: có 8 chủng vi sinh vật sinh hydro trong lần làm giàu thứ 3, ký hiệu là
ST1, ST2, ST3, ST4, ST5, ST6, ST7, ST8. Trong đó, chủng vi sinh vật ST1, ST2, ST3, ST4 phân lập được từ môi trường PY, chủng ST5 và ST6 phân lập được trong môi trường PYG, chủng ST7 và ST8 phân lập được trong cả 2 môi trường PY và PYG (Bảng3.1).
Bảng 3.1: Sản lƣợng khí hydro trong các mẫu làm giàu lần 3
Mẫu phân lập Lƣợng khí hydro tạo thành (mL/L) ST1 459,25 ± 5,31 ST2 0 ST3 47,65 ± 6,03 ST4 568,05 ± 8,27 ST5 439,19 ± 8,42 ST6 35,46 ± 3,54 ST7 161.25 ± 6,84 ST8 255,61 ± 11,83
Bảng 3.1 cho thấy có 4 chủng có khả năng sinh hydro cao nhất gồm : ST1, ST4, ST5, ST8 để tiến hành phân lập các chủng Clostridium sp. có khả năng sinh hydro. Các chủng này được chọn lựa để tiếp tục nghiên cứu.
3.1.1. Đặc điểm hình thái vi khuẩn
Tiến hành nhuộm Gram 4 chủng vi sinh vật và quan sát dưới kính hiển vi có độ phóng đại 100 lần, kết quả cho thấy có 3 chủng có đặc điểm hình thái của lồi
Clostridiumsp : bắt màu tím khi nhuộm Gram chứng tỏ chúng là vi khuẩn Gram dương,
Ảnh khuẩn lạc Ảnh nhuộm Gram Ảnh SEM ST1
ST4
ST5
ST8
Quan sát đặc điểm hình thái của 4 chủng vi khuẩn nhận thấy cả 4 chủng đều có hình que, có 3 chủng Gram dương và chủng ST8 Gram âm. Điều này phù hợp với kết quả của nhiều cơng trình nghiên cứu khoa học đã công bố trước đây cho rằng các chủng vi sinh vật sinh hydro có thể là Gram âm hoặc Gram dương, và có dạng hình que. Các chủng này được nhân giống để phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.1.2. Kết quả định danh bằng khóa phân loại Bergey
Sau khi phân lập được các chủng khác nhau, dựa vào đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa, 4 chủng sẽ được đánh giá dựa vào Khóa phân loại Bergey để tuyển chọn những chủng có khả năng sinh hydro.
Bảng 3.2: Tính chất sinh lý hóa sinh của các chủng đã phân lập từ dạ dày bò
Ký hiệu chủng ST1 ST4 ST5 ST8 Gram + + + - Di động + - + + Catalase - - - + Urease - - - - Indole - + - - Gelatinese + + - Lectin - + - + Citrate - - - + Oxidase - - - - MR + - VP - + + + Khả năng sinh bào tử + + + -
Dựa vào khóa định loại Berey các chủng ST1, ST4, ST5 có các đặc điểm đặc trưng thuộc chi Clostridium như: Gram dương, catalase âm tính, có khả năng sinh bào tử [66].
3.1.3. Kết quả định danh bằng phương pháp 16S rRNA
DNA genome của các chủng vi khuẩn được tách từ một khuẩn lạc đơn sau đó chạy điện di để kiểm tra kích thước genome. Kết quả chạy điện di cho thấy kích thước genome của vi khuẩn là khoảng 10000bp. Đoạn DNA của các chủng vi khuẩn được dùng làm khuôn để tiến hành PCR, nhân bản đoạn gen 16S rRNA nhờ sử dụng cặp mồi đặc hiệu là 27F và 1527R [74].
Sản phẩm PCR được tinh sạch và chạy điện di, kết quả chạy điện di (Hình 3.2) cho thấy sản phẩm PCR lên băng rõ nét, không lên băng phụ, khơng bị nhiễu và có kích thước điện di sản phẩm khoảng 1500bp, phù hợp với kích thước của đoạn gen mã hóa 16S rRNA của vi khuẩn.
Hình 3.2 : Kết quả điện di sản phẩm nhân bản gen 16S rRNA bằng kĩ thuật PCR
Sản phẩm PCR tinh sạch được gửi đi để giải trình tự đoạn gen mã hóa 16S ribosome. Kết quả giải trình tự được Blast trên website https://blast.ncbi.nlm.nih.gov và so sánh mức độ tương đồng (Bảng 3.3) (Phụ lục 1).
Bảng 3.3 : Kết quả định danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử Ký hiệu Ký hiệu
chủng Tên chủng trên GenBank
Tỉ lệ tƣơng đồng (%) NCBI Accession number ST1 Clostridium beijerinckii PS3 100% MF136817 ST4 Clostridium bifermentans DPH-1 99% MF125286 ST5 Clostridum butyricum JCM 1391 100% MF125285 ST8 Enterobacter cloacae MCE64A9 99% MF136819
Kết quả Blast trên NCBI hỗ trợ cho việc định danh sơ bộ theo khóa phân loại Bergy. Khi so sánh kết quả giải trình tự 16S rRNA của các loài tương đồng trên Genbank cho thấy: Chủng ST1 có tỷ lệ tương đồng 100% so với đoạn 16S rRNA của chủng Clostridium beijerinckii PS3và được định danh là Clostridium beijerinckii ST1. Chủng ST4 có tỷ lệ tương đồng 99% so với đoạn 16S rRNA của chủng Clostridium bifermentans DPH-1 và được định danh là Clostridium bifermentans ST4.Chủng ST5
có tỷ lệ tương đồng 100% so với đoạn 16S rRNA của chủng Clostridum butyricum
JCM 1391 và được định danh là Clostridum butyricum ST5. Chủng ST8 có tỷ lệ tương đồng 99% so với chủng Enterobacter cloacae MCE64A9 và được định danh là Enterobacter cloacae ST8.
Kết quả này sẽ được sử dụng cho những nghiên cứu tiếp theo về sản xuất hydro.
3.1.4. Hoạt tính enzyme của các chủng Clostridium sp. phân lập
Việc xác định hoạt tính enzyme của vi sinh vật được thực hiện trong các đĩa thạch petri riêng lẻ. Kết quả xác đinh hoạt tính enzyme được thể hiện dưới Hình 3.3.
Khả năng phân giải protein
Khả năng phân giải tinh bột
Khả năng phân giải cellulose C. beijerinckii ST1 C. bifermentans ST4 C. butyricum ST5
Hình 3.3: Kết quả xác định hoạt tính enzyme của các chủng Clostridium sp.
Độ lớn của vòng tròn phân giải thể hiện khả năng phân giải enzyme của vi sinh vật, điều này cho thấy ở cả 3 chủng thì khả năng phân giải tinh bột là lớn nhất, đối với khả năng phân giải cellulose thì C. bifermentans ST4 và C. butyricum ST5 có khả năng phân giải cao hơn so với C. beijerinckii ST1. Khả năng phân giải protein ở cả ba chủng là tương đương nhau. Kết quả xác định hoạt tính enzyme cho thấy cả ba chủng C.
beijerinckii ST1, C. bifermentans ST4, C. butyricum ST5đều có khả năng phân giải protein, tinh bột và cellulose. Điều này chứng tỏ có thể sử dụng một số nguồn cơ chất thuộc thế hệ thứ 2 để lên men chủng Clostridium sp. để tạo khí hydro sinh học.
Dựa vào khả năng phân giải enzyme của 3 chủng C. beijerinckii ST1,
C.bifermentan ST4, C. butyricum ST5 có thể đề xuất và lựa chọn một số nguồn cơ chất
thuộc thế hệ thứ 2 giàu tinh bột và cellulose như bột sắn, bỗng rượu, bột ngô, bã đậu, bã bia, một số vỏ trái cây như dứa, lê…
3.2. Nghiên cứu quá trình sản xuất hydro sinh học của chủng Clostridium sp.
Qua quá trình phân lập đã tuyển chọn ra được 4 chủng vi sinh vật có khả năng sinh hydro cao trong dạ dày bị. Tuy nhiên, chỉ có 3 chủng thuộc lồi Clostridium sp.
do vậy nghiên cứu đánh giá khả năng sinh hydro được thực hiện trên 3 đối tượng thuộc loài Clostridium sp. là C. beijerinckii ST1, C. bifermentan ST4, C. butyricum ST5. Bên cạnh đó, tiến hành khảo sát với một chủng đối chứng dương là chủng Clostridium beijerinckii NBRC109359 được mua tại ngân hàng gen NBRC của Nhật Bản.
3.2.1. So sánh sản lượng hydro của các chủng Clostridium sp. phân lập được với
một số chủng Clostridium khác
Theo kết quả phân tích ở Bảng 3.4 thì sản lượng hydro được tính dựa trên hàm lượng glucose tiêu thụ là từ 0,7 – 2,47 mol H2/mol glucose trong khi sản lượng hydro cao nhất tính theo lý thuyết đạt mức 4mol H2/mol glucose với điều kiện nguồn cơ chất được chuyển hóa hồn tồn thành acetate (Hình 1.2). Tuy nhiên trong thực tế, sản lượng H2 cũng chỉ đạt mức trên dưới 2 mol H2/mol glucose bởi nguồn cơ chất khơng chỉ được chuyển hóa thành acetate mà cịn được chuyển hóa thành một số axit béo dễ bay hơi khác như butyrate, lactate và ethanol [39].
Qua Bảng 3.4 có thể thấy rằng khi tính theo sản lượng là mol/mol glucose thì sản lượng hydro của chủng C. beijerinckii ST1 đạt 1,36 mol/mol glucose, thấp hơn so với C. bifermentans ST4 (2,47 mol/mol glucose). Điều này được lý giải là do giá trị
OD600 của chủng C. beijerinckii ST1 là 1,794 ± 0,035 cao hơn so với giá trị OD600 của chủng C. bifermentans ST4, chứng tỏ với nguồn carbon là glucose thì chủng C. beijerinckii ST1 sinh trưởng và phát triển mạnh hơn chủng C. bifermentans ST4, do đó
lượng glucose chủng C. beijerinckii ST1 tiêu thụ lớn hơn, điều này dẫn đến sản lượng hydro khi tính theo mol/mol glucose của chủng C. beijerinckii ST1 thấp hơn chủng C.
bifermentans ST4.
Bảng 3.4: Kết quả sản lƣợng hydro của các chủng phân lập
Tên chủng Lƣợng glucose tiêu thụ (g)
Sản lƣợng
hydro (mL/L) OD600
Sản lƣợng H2 (mol /mol glucose tiêu
thụ) C. beijerinckii ST1 3,9 732,15 ± 11,8 1,794 ± 0,035 1,36 C. bifermentans ST4 2,03 675,37 ± 8,32 1,489 ± 0,045 2,47 C. butyricum ST5 6,2 548,4 ± 3,74 1,021 ± 0,023 0,7 C. beijerinckii NBCR 109359 4,2 602,31 ± 4,04 1,469 ± 0,028 1,07
Chủng C. butyricum ST5 cho ra sản lượng hydro thấp nhất, chỉ đạt 0,7 mol
H2/mol glucose (Bảng 3.4), tuy giá trị OD600 chỉ đạt 1,021 ± 0,023 nhưng lượng glucose tiêu thụ lại rất lớn (6,2g). Điều này có thể giải thích là do chủng C. butyricum ST5 có khả năng phân giải đường glucose mạnh hơn, tuy nhiên quá trình phân giải glucose của C. butyricum ST5 không chỉ tạo ra hydro mà cịn có thể hình thành nhiều sản phẩm phụ như ethanol, butyrate, acetic…(Hình 1.2) Vì vậy, sản lượng hydro của
C. butyricum ST5 trong glucose vẫn thấp hơn so với 2 chủng C. bifermentans ST4, và C. beijerinckii ST1
Đã có rất nhiều nghiên cứu nói về khả năng sinh hydro của các lồi Clostridium khác nhau dưới những điều kiện nuôi cấy và nguồn carbon khác nhau. Điều này khiến cho việc so sánh sản lượng hydro của các chủng Clostridium sp.đã phân lập cũng trở
nên khá khó khăn, tuy nhiên sản lượng hydro thu được là từ 0,7 – 2,47 mol H2/mol glucose vẫn có khả năng so sánh được với một số nghiên cứu trước đó, thậm chí cao hơn sản lượng của một số chủng Clostridium sp. khác cũng được nuôi cấy theo mẻ với nguồn cơ chất là glucose. Bảng 3.5 so sánh sản lượng hydro từ quá trình lên men của các chủng ST1, ST4, ST5 với một số chủng khác đã được công bố.
Bảng 3.5: So sánh sản lƣợng hydro của các chủng Clostridium sp. phân lập từ dạ dày bò với một số chủng Clostridium sp. khác
Chủng vi sinh vật Cơ chất (g/L) Nhiệt độ (°C) pH Sản lƣợng H2 (mol/mol glucose)
Tài liệu tham khảo
C. butyricumST5 10 37 6.5 0,7 Nghiên cứu này
C. butyricum CWBI1009 1 - 10 30 - 37 5,2 – 8,0 0,23 – 2,4 [18-20, 23, 40, 56] C. butyricum IFO 3847 1 37 7,0 0,9 [49] C. butyricum IFO 3847 9 37 7,0 1,26 [48] C. butyricum IAM 19002 9 37 7,0 1,04 [48] C. butyricum IAM 19003 9 37 7,0 1,2 [48] C. butyricum A1 10 37 6,5 1,9 [42]
C. beijerinckii ST1 10 37 6,5 1,36 Nghiên cứu này
C. beijerinckii RZF 1108 5 - 9 37 5,0 – 7,0 0,53 – 1,75 [94] C. beijerinckii RZF 1108 9 35 7,0 1,97 [94] C. beijerinckii Fanp3 10 36 6,5 2,52 [65] C. beijerinckii NCIMB8052 5 37 7,0 0,6 - 2.1 [73]
C. beijerinckii NBRC 10 37 6,5 1,07 Nghiên cứu này
C. bifermentans ST4 10 37 6,5 2,47 Nghiên cứu này
Clostridium sp. W1 - 35 - 0,51 [89]
Clostridium sp. AK15 - 60 6,0 0,8 [51]
C. tyrobutyricum
ATCC 25755
30 37 5,7 2,0 [60]
Bảng 3.5 cho thấy các chủng Clostridium sp. khác nhau được lên men ở những điều kiện khác nhau, dải nhiệt độ dao động từ 30 - 60°C, giá trị pH từ 5.0 đến 8.0. Hầu hết các thí nghiệm được thực hiện ở điều kiện 37 °C và pH 7.0. Và ở những điều kiện lên men khác nhau với mỗi chủng khác nhau thì sản lượng hydro thu được cũng khác nhau. Theo Bảng 3.5 thì sản lượng hydro cao nhất ( 2,47 mol H2/mol glucose) thu được là khi lên men chủng C. bifermentans ST4 ở điều kiện 37°C, pH 6.5, hàm lượng
glucose ban đầu là 10 g/L. Điều này chứng tỏ chủng C. bifermentans ST4 phân lập được vơ cùng có ý nghĩa trong nghiên cứu sản xuất hydro sinh học.
Trong 3 chủng C. beijerinckii ST1, C. bifermentans ST4 và C. butyricum ST5 phân lập được thì sản lượng hydro tính theo đơn vị mol H2/ mol glucose của chủng C.
bifermentans ST4 là cao nhất, cao hơn chủng đối chứng C. beijerinckii mua từ ngân hàng NBRC và cao hơn tất cả các chủng Clostridium sp. được so sánh trong Bảng 3.5. Chủng C. butyricum ST5 cho ra sản lượng hydro thấp nhất, sản lượng chỉ đạt mức 0,7 mol H2/mol glucose, tuy nhiên vẫn cao hơn so với một số chủng như chủng C. butyricum CWBI 1009 chỉ đạt 0,23 mol H2/ mol glucose khi nuôi ở điều kiện 30°C, pH
5.2 [18-20, 63]. Chủng C. beijerinckii RZF 1108 cũng chỉ cho ra sản lượng hydro đạt
mức 0,53 mol/mol glucsoe tiêu thụ khi lên men ở điều kiện hàm lượng nguồn cơ chất ban đầu là 5 g/L, nhiệt độ 37°C, pH 5.0 [94]. Chủng Clostridium sp. W1 có sản lượng hydro cũng tương đối thấp, sản lượng hydro thu được là 0,51 mol/mol glucose ở nhiệt độ 35°C [89]. Kết quả so sánh cho thấy tuy sản lượng hydro thu được từ các chủng phân lập tuy không cao nhưng để so sánh với kết quả trên thế giới thì đây vẫn là một
kết quả đáng mong đợi và cần được nghiên cứu nhiều hơn nữa để làm tăng sản lượng hydro.
3.2.2. Khảo sát khả năng trưởng và sinh khí hydo của chủng Clostridium sp. trên
một số nguồn cơ chất có sẵn
Nghiên cứu của Jianlong Wang và Wei Wan đã chỉ ra rằng nguồn cơ chất là một trong những yếu tố có ảnh hưởng rất lớn tới sản lượng hydro sinh ra trong quá trình lên men [43]. Trong khuôn khổ đề tài, 5 loại cơ chất được lựa chọn để tiến hành nghiên cứu là glucose, sucrose, lactose, xylose, và molasses (rỉ đường) bởi đây là những nguồn cơ chất đã được xác định là có thể bị thủy phân tạo thành hydro bởi các lồi thuộc chi Clostridium. Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần, sau đó theo dõi khả năng sinh trưởng và sinh khí của các chủng vi sinh vật.
3.2.2.1. Khả năng sinh trưởng và sinh khí trên một số nguồn cơ chất có sẵn khi lên men đơn chủng. đơn chủng.
Tiến hành thí nghiện nghiên cứu khả năng sinh trưởng và sinh khí hydro khi lên men đơn chủng các chủng Clostridium sp. đã phân lập được trên 5 nguồn cơ chất có
sẵn là glucose, sucrose, lactose, xylose và molasses (rỉ đường) thu được kết quả như sau:
Hình 3.4: Khả năng sinh trƣởng và sinh khí khi lên men đơn chủng các chủng
Clostridium sp. trên một số nguồn cơ chất có sẵn
Hình 3.4 cho thấy trong 5 lọại cơ chất khảo sát thì cả 4 loại đường glucose, sucrose, lactose, xylose đều phù hợp để lên men sản xuất hydro. Tùy thuộc vào loại cơ chất và các chủng khác nhau mà sản lượng hydro thu được cũng khác nhau. Đối với nguồn cơ chất glucose, sản lượng hydro cao nhất thu được là 732,15 ± 11,8 mL/L khi lên men chủng C. beijerinckii ST1, phần trăm khí hydro thu được là 51,7 % (Phụ lục 3) giá trị OD600 đạt 1,794 ± 0,035. Kết quả này tương tự với kết quả của Fumiaki Taguchi và cộng sự sản lượng hydro đạt 740 ± 29,6mL/L khi lên men chủng
C.beijerinckii AM21B [37]. Glucose cũng là nguồn cơ chất phù hợp với chủng