Độ lớn của vòng tròn phân giải thể hiện khả năng phân giải enzyme của vi sinh vật, điều này cho thấy ở cả 3 chủng thì khả năng phân giải tinh bột là lớn nhất, đối với khả năng phân giải cellulose thì C. bifermentans ST4 và C. butyricum ST5 có khả năng phân giải cao hơn so với C. beijerinckii ST1. Khả năng phân giải protein ở cả ba chủng là tương đương nhau. Kết quả xác định hoạt tính enzyme cho thấy cả ba chủng C.
beijerinckii ST1, C. bifermentans ST4, C. butyricum ST5đều có khả năng phân giải protein, tinh bột và cellulose. Điều này chứng tỏ có thể sử dụng một số nguồn cơ chất thuộc thế hệ thứ 2 để lên men chủng Clostridium sp. để tạo khí hydro sinh học.
Dựa vào khả năng phân giải enzyme của 3 chủng C. beijerinckii ST1,
C.bifermentan ST4, C. butyricum ST5 có thể đề xuất và lựa chọn một số nguồn cơ chất
thuộc thế hệ thứ 2 giàu tinh bột và cellulose như bột sắn, bỗng rượu, bột ngô, bã đậu, bã bia, một số vỏ trái cây như dứa, lê…
3.2. Nghiên cứu quá trình sản xuất hydro sinh học của chủng Clostridium sp.
Qua quá trình phân lập đã tuyển chọn ra được 4 chủng vi sinh vật có khả năng sinh hydro cao trong dạ dày bị. Tuy nhiên, chỉ có 3 chủng thuộc lồi Clostridium sp.
do vậy nghiên cứu đánh giá khả năng sinh hydro được thực hiện trên 3 đối tượng thuộc loài Clostridium sp. là C. beijerinckii ST1, C. bifermentan ST4, C. butyricum ST5. Bên cạnh đó, tiến hành khảo sát với một chủng đối chứng dương là chủng Clostridium beijerinckii NBRC109359 được mua tại ngân hàng gen NBRC của Nhật Bản.
3.2.1. So sánh sản lượng hydro của các chủng Clostridium sp. phân lập được với
một số chủng Clostridium khác
Theo kết quả phân tích ở Bảng 3.4 thì sản lượng hydro được tính dựa trên hàm lượng glucose tiêu thụ là từ 0,7 – 2,47 mol H2/mol glucose trong khi sản lượng hydro cao nhất tính theo lý thuyết đạt mức 4mol H2/mol glucose với điều kiện nguồn cơ chất được chuyển hóa hồn tồn thành acetate (Hình 1.2). Tuy nhiên trong thực tế, sản lượng H2 cũng chỉ đạt mức trên dưới 2 mol H2/mol glucose bởi nguồn cơ chất khơng chỉ được chuyển hóa thành acetate mà cịn được chuyển hóa thành một số axit béo dễ bay hơi khác như butyrate, lactate và ethanol [39].
Qua Bảng 3.4 có thể thấy rằng khi tính theo sản lượng là mol/mol glucose thì sản lượng hydro của chủng C. beijerinckii ST1 đạt 1,36 mol/mol glucose, thấp hơn so với C. bifermentans ST4 (2,47 mol/mol glucose). Điều này được lý giải là do giá trị
OD600 của chủng C. beijerinckii ST1 là 1,794 ± 0,035 cao hơn so với giá trị OD600 của chủng C. bifermentans ST4, chứng tỏ với nguồn carbon là glucose thì chủng C. beijerinckii ST1 sinh trưởng và phát triển mạnh hơn chủng C. bifermentans ST4, do đó
lượng glucose chủng C. beijerinckii ST1 tiêu thụ lớn hơn, điều này dẫn đến sản lượng hydro khi tính theo mol/mol glucose của chủng C. beijerinckii ST1 thấp hơn chủng C.
bifermentans ST4.
Bảng 3.4: Kết quả sản lƣợng hydro của các chủng phân lập
Tên chủng Lƣợng glucose tiêu thụ (g)
Sản lƣợng
hydro (mL/L) OD600
Sản lƣợng H2 (mol /mol glucose tiêu
thụ) C. beijerinckii ST1 3,9 732,15 ± 11,8 1,794 ± 0,035 1,36 C. bifermentans ST4 2,03 675,37 ± 8,32 1,489 ± 0,045 2,47 C. butyricum ST5 6,2 548,4 ± 3,74 1,021 ± 0,023 0,7 C. beijerinckii NBCR 109359 4,2 602,31 ± 4,04 1,469 ± 0,028 1,07
Chủng C. butyricum ST5 cho ra sản lượng hydro thấp nhất, chỉ đạt 0,7 mol
H2/mol glucose (Bảng 3.4), tuy giá trị OD600 chỉ đạt 1,021 ± 0,023 nhưng lượng glucose tiêu thụ lại rất lớn (6,2g). Điều này có thể giải thích là do chủng C. butyricum ST5 có khả năng phân giải đường glucose mạnh hơn, tuy nhiên quá trình phân giải glucose của C. butyricum ST5 khơng chỉ tạo ra hydro mà cịn có thể hình thành nhiều sản phẩm phụ như ethanol, butyrate, acetic…(Hình 1.2) Vì vậy, sản lượng hydro của
C. butyricum ST5 trong glucose vẫn thấp hơn so với 2 chủng C. bifermentans ST4, và C. beijerinckii ST1
Đã có rất nhiều nghiên cứu nói về khả năng sinh hydro của các lồi Clostridium khác nhau dưới những điều kiện ni cấy và nguồn carbon khác nhau. Điều này khiến cho việc so sánh sản lượng hydro của các chủng Clostridium sp.đã phân lập cũng trở
nên khá khó khăn, tuy nhiên sản lượng hydro thu được là từ 0,7 – 2,47 mol H2/mol glucose vẫn có khả năng so sánh được với một số nghiên cứu trước đó, thậm chí cao hơn sản lượng của một số chủng Clostridium sp. khác cũng được nuôi cấy theo mẻ với nguồn cơ chất là glucose. Bảng 3.5 so sánh sản lượng hydro từ quá trình lên men của các chủng ST1, ST4, ST5 với một số chủng khác đã được công bố.
Bảng 3.5: So sánh sản lƣợng hydro của các chủng Clostridium sp. phân lập từ dạ dày bò với một số chủng Clostridium sp. khác
Chủng vi sinh vật Cơ chất (g/L) Nhiệt độ (°C) pH Sản lƣợng H2 (mol/mol glucose)
Tài liệu tham khảo
C. butyricumST5 10 37 6.5 0,7 Nghiên cứu này
C. butyricum CWBI1009 1 - 10 30 - 37 5,2 – 8,0 0,23 – 2,4 [18-20, 23, 40, 56] C. butyricum IFO 3847 1 37 7,0 0,9 [49] C. butyricum IFO 3847 9 37 7,0 1,26 [48] C. butyricum IAM 19002 9 37 7,0 1,04 [48] C. butyricum IAM 19003 9 37 7,0 1,2 [48] C. butyricum A1 10 37 6,5 1,9 [42]
C. beijerinckii ST1 10 37 6,5 1,36 Nghiên cứu này
C. beijerinckii RZF 1108 5 - 9 37 5,0 – 7,0 0,53 – 1,75 [94] C. beijerinckii RZF 1108 9 35 7,0 1,97 [94] C. beijerinckii Fanp3 10 36 6,5 2,52 [65] C. beijerinckii NCIMB8052 5 37 7,0 0,6 - 2.1 [73]
C. beijerinckii NBRC 10 37 6,5 1,07 Nghiên cứu này
C. bifermentans ST4 10 37 6,5 2,47 Nghiên cứu này
Clostridium sp. W1 - 35 - 0,51 [89]
Clostridium sp. AK15 - 60 6,0 0,8 [51]
C. tyrobutyricum
ATCC 25755
30 37 5,7 2,0 [60]
Bảng 3.5 cho thấy các chủng Clostridium sp. khác nhau được lên men ở những điều kiện khác nhau, dải nhiệt độ dao động từ 30 - 60°C, giá trị pH từ 5.0 đến 8.0. Hầu hết các thí nghiệm được thực hiện ở điều kiện 37 °C và pH 7.0. Và ở những điều kiện lên men khác nhau với mỗi chủng khác nhau thì sản lượng hydro thu được cũng khác nhau. Theo Bảng 3.5 thì sản lượng hydro cao nhất ( 2,47 mol H2/mol glucose) thu được là khi lên men chủng C. bifermentans ST4 ở điều kiện 37°C, pH 6.5, hàm lượng
glucose ban đầu là 10 g/L. Điều này chứng tỏ chủng C. bifermentans ST4 phân lập được vô cùng có ý nghĩa trong nghiên cứu sản xuất hydro sinh học.
Trong 3 chủng C. beijerinckii ST1, C. bifermentans ST4 và C. butyricum ST5 phân lập được thì sản lượng hydro tính theo đơn vị mol H2/ mol glucose của chủng C.
bifermentans ST4 là cao nhất, cao hơn chủng đối chứng C. beijerinckii mua từ ngân hàng NBRC và cao hơn tất cả các chủng Clostridium sp. được so sánh trong Bảng 3.5. Chủng C. butyricum ST5 cho ra sản lượng hydro thấp nhất, sản lượng chỉ đạt mức 0,7 mol H2/mol glucose, tuy nhiên vẫn cao hơn so với một số chủng như chủng C. butyricum CWBI 1009 chỉ đạt 0,23 mol H2/ mol glucose khi nuôi ở điều kiện 30°C, pH
5.2 [18-20, 63]. Chủng C. beijerinckii RZF 1108 cũng chỉ cho ra sản lượng hydro đạt
mức 0,53 mol/mol glucsoe tiêu thụ khi lên men ở điều kiện hàm lượng nguồn cơ chất ban đầu là 5 g/L, nhiệt độ 37°C, pH 5.0 [94]. Chủng Clostridium sp. W1 có sản lượng hydro cũng tương đối thấp, sản lượng hydro thu được là 0,51 mol/mol glucose ở nhiệt độ 35°C [89]. Kết quả so sánh cho thấy tuy sản lượng hydro thu được từ các chủng phân lập tuy không cao nhưng để so sánh với kết quả trên thế giới thì đây vẫn là một
kết quả đáng mong đợi và cần được nghiên cứu nhiều hơn nữa để làm tăng sản lượng hydro.
3.2.2. Khảo sát khả năng trưởng và sinh khí hydo của chủng Clostridium sp. trên
một số nguồn cơ chất có sẵn
Nghiên cứu của Jianlong Wang và Wei Wan đã chỉ ra rằng nguồn cơ chất là một trong những yếu tố có ảnh hưởng rất lớn tới sản lượng hydro sinh ra trong quá trình lên men [43]. Trong khuôn khổ đề tài, 5 loại cơ chất được lựa chọn để tiến hành nghiên cứu là glucose, sucrose, lactose, xylose, và molasses (rỉ đường) bởi đây là những nguồn cơ chất đã được xác định là có thể bị thủy phân tạo thành hydro bởi các loài thuộc chi Clostridium. Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần, sau đó theo dõi khả năng sinh trưởng và sinh khí của các chủng vi sinh vật.
3.2.2.1. Khả năng sinh trưởng và sinh khí trên một số nguồn cơ chất có sẵn khi lên men đơn chủng. đơn chủng.
Tiến hành thí nghiện nghiên cứu khả năng sinh trưởng và sinh khí hydro khi lên men đơn chủng các chủng Clostridium sp. đã phân lập được trên 5 nguồn cơ chất có
sẵn là glucose, sucrose, lactose, xylose và molasses (rỉ đường) thu được kết quả như sau:
Hình 3.4: Khả năng sinh trƣởng và sinh khí khi lên men đơn chủng các chủng
Clostridium sp. trên một số nguồn cơ chất có sẵn
Hình 3.4 cho thấy trong 5 lọại cơ chất khảo sát thì cả 4 loại đường glucose, sucrose, lactose, xylose đều phù hợp để lên men sản xuất hydro. Tùy thuộc vào loại cơ chất và các chủng khác nhau mà sản lượng hydro thu được cũng khác nhau. Đối với nguồn cơ chất glucose, sản lượng hydro cao nhất thu được là 732,15 ± 11,8 mL/L khi lên men chủng C. beijerinckii ST1, phần trăm khí hydro thu được là 51,7 % (Phụ lục 3) giá trị OD600 đạt 1,794 ± 0,035. Kết quả này tương tự với kết quả của Fumiaki Taguchi và cộng sự sản lượng hydro đạt 740 ± 29,6mL/L khi lên men chủng
C.beijerinckii AM21B [37]. Glucose cũng là nguồn cơ chất phù hợp với chủng C.bifermentas ST4 với sản lượng hydro đạt 675,37 ± 8,32 mL/L , giá trị OD600 là 1,489 ± 0,045. Sản lượng hydro thu được đối với chủng C. butyricum ST5 khi sử dụng nguồn cơ chất là glucose tuy thấp hơn, đạt 548,4 ± 3,74 mL/L nhưng cũng có thể nói glucose là một trong những nguồn carbon rất phù hợp để lên men sản xuất hydro sinh
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 0 100 200 300 400 500 600 700 800
Glucose Sucrose Lactose Xylose Molasses
Sản lƣợ ng H2 ( m L/ L) Nguồn carbon
C. beijerinckii ST1 Sản lượng H2 C. bifermentans ST4 Sản lượng H2 C. butyricum ST5 Sản lượng H2 C. beijerinckii ST1 OD600
học bởi glucose tham gia trực tiếp vào quá trình đường phân tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình sinh trưởng của tế bào vi khuẩn, chủng phát triển nhanh và cho sản lượng hydro cao. Kết quả trên cho thấy rằng gluose là nguồn carbon phù hợp để lên men sản xuất hydro, kết quả này tương tự với những nghiên cứu đã được cơng bố trước đó [58, 67], theo nghiên cứu của Pei-Ping L. và cộng sự thì sản lượng hydro đạt 2,81 mol/mol glucose khi lên men chủng C. beijerinckii L9, chủng C. butyricum ATCC19398 sản
lượng hydro đạt 1.8 mol/ mol glucose [67], hay theo như nghiên cứu của Kataoka và cộng sự sản lượng hydro đạt mức 1,4-2,3 mol/mol glucose [50], bên cạnh đó Mei - Ling C. và cộng sự cũng thu được sản lượng hydro là 948 mL/L khi lên men chủng C.
beijeringckii EB6 [57].
Sucrose tuy không phải là đường đơn nhưng cũng được coi là một trong những nguồn cơ chất phù hợp để lên men sản xuất hydro, các nghiên cứu trước đây cũng cho thấy rằng sản lượng hydro khi lên men với sucrosecũng tương đối cao, theo như kết quả nghiên cứu của Chen và cộng sự thìsản lượng hydro thu được lên tới 2.78 mol/mol sucrose khi lên men chủng C. butyricum CGS5 [29].Trong nghiên cứu này thì sản
lượng thu được cao nhất là khi lên men chủng C. bifermentans ST4 với sản lượng hydro là 725,8 ± 5,6mL/L, chiếm tới55,3% tổng thể tích khí sinh ra (Phụ lục 3 ), giá trị OD đạt 1,694 ± 0,014, chủng C. beijerinckii ST1 sản lượng hydro thu được là 654
±8,12 mL/L, giá trị OD600 đạt mức 1,634 ± 0,057, sản lượng hydro thu được từ chủng
C. butyricum ST5 là 606,4 ± 2,08 mL/L, giá trị OD600 đạt 1,094 ± 0,034, tuy thấp hơn
so với C. beijerinckii ST1 và C. bifermentans ST4 nhưng không đáng kể. Kết quả này cũng cho thấy rằng sucrose cũng là một trong những nguồn carbon thích hợp cho q trình lên men tối sản xuất hydro.
Lactose tuy không cho sản lượng hydro cao như glucose và sucrose nhưng đây cũng là nguồn cơ chất tương đối phù hợp với chủng C. bifermentans ST4 với sản lượng hydro thu được là 585,5 ± 4,89 mL/L. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của
Fumiaki Taguchi và cộng sự, sản lượng hydro thu được là 17,9 mmol/g lactose khi lên men chủng C. beijerinckii AM21B [37]. Hay như kết quả nghiên cứu của Collet C. và cộng sự, sản lượng hydro đạt mức 2,48 mmol/mol lactose/h [27]. Hình 3.4 cũng cho thấy rằng, xylose là nguồn cơ chất cho ra sản lượng hydro ở mức trung bình, sản lượng thu được là 387,75 ± 5,25 mL/L, 417 ± 6 mL/L, 364,8 ± 1,67 mL/L khi lên men các chủng C. beijerinckii ST1, C. bifermentans ST4, C. butyricum ST5, theo thứ tự.
Biểu đồ cũng cho thấy rằng rỉ đường không phải là một nguồn cơ chất phù hợp để lên men sản xuất hydro sinh học, sản lượng cao nhất thu được chỉ đạt 33,75 ± 5,34 mL/L khi lên men chủng C. beijerinckii ST1. Kết quả này thấp hơn với nghiên cứu của Xiaoyi Wang và Bo Jin, sản lượng hydro thu được là 0,74 mol/mol hexose [90] và 1,22 mol/mol hexose khi lên men chủng C. butyricum W5với hàm lượng molasses 20 g/L[91].
3.2.2.2. Khả năng sinh trưởng và sinh khí trên một số nguồn cơ chất có sẵn khi lên men kết hợp 2 chủng men kết hợp 2 chủng
Dựa vào kết quả ni đơn chủng, 3 nguồn carbonđược chọn có khả năng sinh hydro cao nhất là sucrose, glucose và lactose. Tiến hành khảo sát khả năng sinh trưởng và sinh khí khi lên men kết hợp 2 chủng Clostridium sp. (tỷ lệ 1:1) với 3 nguồn cơ chất là sucrose, glucose, lactose, điều kiện lên men là 37°C, thời gian lên men 48h, tốc độ lắc 200 rpm. Kết quả thu được như Hình 3.5:
Hình 3.5 cũng cho thấy sản lượng hydro cao nhất là khi lên men kết hợp chủng
C. butyricum ST5và C. bifermentans ST4 với nguồn cơ chất là glucose, phần trăm khí
hydro thu được là 54,7% (Phụ lục 3),sản lượng hydro đạt mức 793,8 ± 8,12 mL/L, cao hơn 1,17 – 1,44 lần so với lên men đơn chủng và cao hơn sản lượng hydro cao nhất thu được khi lên men chủng C. beijerinckii ST1 (732,15 ± 11,8 mL/L). Đồng thời, giá trị
OD600 cũng tăng lên từ 1,021 ± 0,023 – 1,965 ± 0,056 so với lên men đơn chủng, điều này cho thấy rằng với nguồn cơ chất là glucose thì 2 chủng C. butyricum ST5 và C.
bifermentans ST4 sinh trưởng và sinh khí tốt hơn do có sự tương tác và bổ trợ cho nhau
trong quá trình phân giải glucose tạo hydro. Tuy nhiên, khi lên men kết hợp 2 chủng C.
butyricum ST5 và C. beijerinckii ST1 thì sản lượng hydro lại giảm đi 18% so với sản
lượng hydro khi lên men đơn chủng C. beijerinckii ST1, giá trị OD cũng giảm từ 1,794 ± 0,035 xuống còn 1,632 ± 0,031. Kết quả này cũng tương tự khi lên men kết hợp 2 chủng C. beijerinckii ST1 và C. bifermentans ST4, điều này có thể giải thích là do có
thể đã có sự cạnh tranh thức ăn giữa 2 chủng vi sinh vật
Hình 3.5 : Khả năng sinh trƣởng và sinh khí khi lên men kết hợp 2 chủng
Clostridium sp. trên một số nguồn cơ chất có sẵn
0 0,5 1 1,5 2 2,5 0,0 100,0 200,0 300,0 400,0 500,0 600,0 700,0 800,0 900,0
Sucrose Glucose Lactose
S ản lƣợng (m L /L ) Nguồn carbon
C. butyricum ST5 + C. bifermentan ST4 sản lượng H2 C. butyricum ST5+ C. beijerinckii ST1 sản lượng H2 C. beijerinckii ST1 + C. bifermentan ST4 sản lượng H2 C. butyricum ST5 + C. bifermentan ST4 OD600 C. butyricum ST5+ C. beijerinckii ST1 OD600 C. beijerinckii ST1 + C. bifermentan ST4 OD600
. Với nguồn cơ chất là sucrose thì sản lượng hydro cao nhất thu được là ở mơ hình lên men kết hợp 2 chủng C. butyricum ST5 và C. beijerinckii ST1, sản lượng thu được là 699,8 ± 8,69mL/L, chiếm 55,1 % tổng thể tích khí sinh ra ( Phụ lục 3), cao hơn 1,15 – 1,07 lần so với lên men đơn chủng, giá trị OD tăng từ 1,094 ± 0,034 lên tới 1,765 ± 0,054. Kết quả này chứng tỏ rằng với nguồn cơ chất là sucrose thì 2 chủng C.
butyricum ST5 và C. beijerinckii ST1 có sự tương tác và bổ trợ cho nhau trong quá