2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp xử lý mẫu và nuôi cấy
- Các mẫu thu thập được pha loãng trong nước cất, tiền xử lý mẫu bằng máy gia nhiệt ở 1000 C trong 30 phút [28].
- 8mL môi trường sẽ được cho vào bình serum 15mL sau đó được đóng nắp cao su và nắp nhơm bên ngồi.
- Headspace của bình serum được sục khí N2 tinh khiết để loại bỏ hết O2 trong bình nhằm tạo mơi trường kị khí. Khi mơi trường trở lên trong suốt và lắc lên khơng
• Thu mẫu dạ dày bị tại Huyện Quốc Oai, Tp. Hà Nội
Thu mẫu
• Ni cấy mẫu trong bình serum, xác định lượng hydro sinh ra từ mỗi mẫu, chọn các mẫu cho sản lượng hydro cao (ml/L mơi trường)
Làm giàu và thử sinh hydro
• Phân lập các vi sinh vật kị khí sinh hydro trong mẫu được chọn và định danh bằng khóa định loại Bergey kết hợp kĩ thuật sinh học phân tử Phân lập và định danh
• So sánh sản lượng hydro của các chủng phân lập được với một số chủng Clostridium khác
So sánh sản lượng hydro
• Khảo sát khả năng sinh hydro trên một số nguồn cơ chất được thực hiện với mơ hình lên men đơn chủng và lên men kết hợp
Khảo sát khả năng sinh hydro trên một số nguồn cơ
chất có sẵn
• Sử dụng phần mềm DX7.1.5 và mơ hình thí nghiệm của Box-Behnken để tối ưu hóa điều kiện lên men làm tăng sản lượng hydro
Tối ưu hóa điều kiện lên men bằng phương pháp đáp
ứng bề mặt
• Nghiên cứu khả năng sinh khí hydro khi lên men với nguồn cơ chất là bột bã sắn và bỗng rượu.
Khả sát khả năng sinh khí hydro trên một số nguồn cơ
còn thấy hiện tượng chuyển sang màu hồng của thuốc thử thì mơi trường đã sẵn sàng cho việc làm giàu chủng.
Hình 2.2: Phƣơng pháp sục khí nitơ
- Cấy giống từ 5-10% (v/v) khi vẫn đang tiến hành sục khí N2.
- Cuối cùng cho bình serum đã cấy vào bể lắc ổn nhiệt và nuôi cấy ở 37oC, 200 rpm.
- Sau 2 ngày ni cấy chọn những mẫu có khả năng sinh khí hydro cao cấy chuyển sang bình làm giàu lần thứ hai và thứ ba để phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo.
- Lấy dịch ni cấy lần thứ 3 pha lỗng, cấy trải trên đĩa thạch mơi trường PYA, PYGA trong tủ ni cấy kị khí.
- Sau 24- 48 giờ, quan sát và lựa chọn những khuẩn lạc to, riêng rẽ nuôi lại kiểm tra khả năng sinh H2.
- Từ các đĩa Petri chọn ra các khuẩn lạc riêng rẽ dựa vào đặc điểm khác nhau về hình dáng, kích thước, màu sắc, bề mặt, mép, độ lồi. Sau đó chúng tơi đã ni thuần chủng tinh khiết và giữ giống phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo.
Các chủng thuần khiết phân lập được sẽ được thử nghiệm về hình thái, tính chất sinh lý, sinh hóa. Mặc dù phương pháp này khơng hồn tồn chính xác nhưng đây là bước đầu tiên trong nghiên cứu phân loại vi sinh vật. Các thí nghiệm được thực hiện như sau [3]: