Vi sinh vật
Điều kiện nuôi cấy Sản lƣợng Hydro (mol/mol cơ chất) Tham khảo Phƣơng thức nuôi cấy pH Nhiệtđộ 0 C Cơ chất Kị khí nghiêm ngặt
Clostridiumsp. no 2 Liên tục 6,5 36 Glucose 2,4 [83] C.paraputrificum M-21 Theo mẻ
(batch)
Không
Sản lượng hydro của nuôi cấy các chủng thuần khiết thuộc chi Clostridium đã
được nghiên cứu, bao gồm C. paraputrificum, C. lentocellum, C. thermosuccinogenes,
C. bifermentans,C. thermolacticum, C. butyricum, C. saccharoperbutylacetonicum, C. acetobutylicum, và C. pasteurianum. Sản lượng hydro tối ưu được theo dõi với mỗi
loài, thay đổi từ 1.1 mol H2/mol hexose đến 2.6 mol H2/mol hexose, phụ thuộc vào bản chất của sinh vật cũng như điều kiện môi trường [46].
Clostridium PROH2 Theo mẻ
(batch) 9,5 37 Glucose 2,7 [59]
C. beijerinckii YA001 Theo mẻ
(batch) 8,0 40 Xylose 2,3 [32]
Siêu ƣa nhiệt
Thermotoga maritina Theo mẻ
(batch) Không điều chỉnh 80 Glucose 4,0 [72] T. elfi Theo mẻ (batch) 7,0 65 Glucose 3,3 [86] Caldicellulosiruptor Saccharolyticus Theo mẻ (batch) 7,0 70 Sucrose 3,3 [86] Thermoanerobacteriumth ermosaccharolyticum W16 Theo mẻ (batch) 7,5 70 Glucose 2,42 [70] Kị khí tùy tiện Enterobacter aerogens E.2005 Theo mẻ (batch) 6,0 38 Glucose 1,0 [84]
E. cloacae IIT-BT 08 wt Theo mẻ
(batch) Không điều chỉnh 36 Gluccse 2,2 [52] E. aerogenes HU-101 MAY-2 Liên tục Không điều chỉnh 37 Glucose 1,0 [68] Bacillus firmus NMBL- 03 Theo mẻ (batch) 6,5 38 Đường khử 1,08 [64] Citrobacter sp. CMC-1 Theo mẻ (batch) 6,0 34 Glucose 1,82 [55]
Bảng 1.3: Sản lƣợng hydro từ các cơ chất khác nhau của một số loài thuộc chi
Clostridium [87]
Cơ chất Vi sinh vật Sản lƣợng H2
Tinh bột sắn Clostridium acetobutycium 2,41 mol H2/mol glucose Tinh bột ngô Clostridium pasteurianum 194 mL H2/g tinh bột Tinh bột khoai tây Clostridium butyricum 2,4 mol H2/mol glucose
Tinh bột Clostridium butyricum 1,9 mol H2/mol glucose Tinh bột ngô Clostridium butyricum 390 mL H2/g tinh bột
Tinh bột Clostridium amydalinum C9 2,6 mol H2/mol glucose Nước thải Clostridium butyricum 2,7 mol H2/mol glucose Tinh bột mì Clostridium beijerinkii 90 L H2/g tinh bột
Theo nghiên cứu của Leena B và cộng sự, chủng Clostridiumsp. DMHC -10 cho sản lượng hydro 3.35 mol H2/mol glucose tại điều kiện nhiệt độ 370 C, pH 7 [45]. Vi khuẩn kị khí bắt buộc như Clostridium beijerincki AM21B có thể tạo ra hydro với hàm lượng 1.8 đến 2.0 mol H2/mol glucose [95]. Theo nghiên cứu của Dan An và cộng sự
Clostridium beijerinckiiYA001 cũng là chủng đã được chứng tỏ có khả năng sinh ra
hydro với sản lượng cao, đạt 2.31 mol/mol xylose tại điều kiện pH 8.0, nhiệt độ 400C [32]. Clostridium saccharoperbutylacetoniciun N1-4 trong điều kiện ni cấy theo mẻ
có thể cho sản lượng hydro đạt 4.628-7627 mL H2/L với cơ chất là rác thải nơng nghiệp đã qua xử lí, bao gồm cám gạo, cám gạo loại dầu, tinh bột cây cọ và chất thải từ nhà máy sản xuất dầu cọ [87]. Clostridium acetobutycium cho sản lượng 2.41 mol H2/ mol glucose khi sử dụng nguồn cơ chất là tinh bột sắn [87]. Những kết quả này cho thấy các
chủng Clostridium sp. có thể được ứng dụng để sản xuất H2 trên cellulose và hemicellulose tồn tại dồi dào trong sinh khối cũng như rác thải nông nghiệp [87].
1.7. Thách thức và triển vọng của phƣơng pháp lên men tối
1.7.1. Thách thức
Sản xuất hydro theo phương pháp lên men kỵ khí đắt hơn so với những nguyên liệu khác.
Công nghệ này vẫn chưa cạnh tranh được với quy trình sản xuất hydro quy mơ thương mại từ nhiên liệu hóa thạch về giá thành, hiệu quả và tính tin cậy.
Hầu hết các nghiên cứu được thực hiện trong quy mơ phịng thí nghiệm, chỉ có một vài nghiên cứu được thực hiện trên quy mơ thí điểm được thực hiện cho tới nay[64].
1.7.2. Triển vọng
Một vài khẳng định về cơng nghệ lên men hydro yếm khí như tỷ lệ sản xuất cao, nhu cầu năng lượng thấp, hoạt động đơn giản và có khả năng chống chịu đã được chứng minh trong những nghiên cứu phịng thí nghiệm.
Cho đến nay, những nghiên cứu về sản xuất hydro đã cho thấy rằng lên men tối hydro có thể được chọn lựa để sản xuất hydro từ sinh khối tái tạo. Có sự cải thiện và phát triển đáng kể cả về sản lượng và tỷ lệ sản xuất hydro [64].
1.8. Đặc điểm hệ vi sinh vật dạ cỏ
Dạ cỏ là túi lớn nhất, chiếm hầu hết nửa trái của xoang bụng, từ cơ hồnh đến xương chậu. Dạ cỏ chiếm 85-90% dung tích dạ dày, 75% dung tích đường tiêu hố, có tác dụng tích trữ, nhào trộn và chuyển hố thức ăn. Dạ cỏ khơng có tuyến tiêu hố mà niêm mạc có nhiều núm hình gai. Sự tiêu hố thức ăn trong đó là nhờ hệ vi sinh vật (VSV) cộng sinh. Dạ cỏ có mơi trường thuận lợi cho VSV lên men yếm khí: yếm khí, nhiệt độ tương đối ổn định trong khoảng 38-42°C, pH từ 5,5-7,4. Trong đó các lồi
thuộc chi Clostridium đóng vai trị phân giải protein để giúp hệ vi sinh vật trong dạ cỏ sinh trưởng và phát triển tạo sinh khối protein, đặc biệt một số loài như Clostridium butyricum cịn có khả năng phân giải cellulose giúp tiêu hóa thức ăn nhanh hơn [13].
Hệ vi sinh vật dạ cỏ rất phức tạp và phụ thuộc nhiều vào khẩu phần. Hệ vi sinh vật dạ cỏ gồm có 3 nhóm chính: vi khuẩn (Bacteria), động vật ngun sinh (Protozoa) và nấm (Fungi).
1.8.1. Vi khuẩn (Bacteria)
Trong dạ cỏ có khoảng 60 lồi vi khuẩn đã được xác định. Sự phân loại vi khuẩn dạ cỏ có thể được tiến hành dựa vào cơ chất mà vi khuẩn sử dụng hay sản phẩm lên men cuối cùng của chúng [14].
- Vi khuẩn phân giải cellulose. Vi khuẩn phân giải xenluloza có số lượng rất lớn trong dạ cỏ. Những loài vi khuẩn phân giải xenluloza quan trọng nhất là Bacteroides succinogenes, Butyrivibrio fibrisolvens, Ruminoccocus flavefaciens, Ruminococcus albus, Cillobacterium cellulosolvens [12].
- Vi khuẩn phân giải hemicellulose: Những vi khuẩn có khả năng thuỷ phân cellulose thì cũng có khả năng sử dụng hemi cellulose.. Các loài vi khuẩn phân giải hemicellulose cũng như vi khuẩn phân giải cellulose đều bị ức chế bởi pH thấp.
- Vi khuẩn phân giải tinh bột: Phần lớn tinh bột theo thức ăn vào dạ cỏ được phân giải nhờ sự hoạt động của VSV. Những loài vi khuẩn phân giải tinh bột quan trọng là Bacteroides amylophilus, Succinimonas amylolytica, Butyrivibrio fibrisolbvens, Bacteroides ruminantium, Selenomonas ruminantium và Steptococcus bovis.
- Vi khuẩn phân giải đường: Hầu hết các vi khuẩn sử dụng được các loại polysaccharid nói trên thì cũng sử dụng được đường disaccharid và đường
monosaccharid. Các vi khuẩn thuộc loài Lachnospira multiparus, Selenomonas ruminantium... đều có khả năng sử dụng tốt hydratcacbon hồ tan.
- Vi khuẩn sử dụng các axit hữu cơ: Hầu hết các vi khuẩn đều có khả năng sử dụng axit lactic, một số có thể sử dụng axit succinic, malic, fumaric, formic hay acetic. Những loài sử dụng axit lactic là Veillonella gazogenes, Veillonella alacalescens, Peptostreptococcus elsdenii, Propioni bacterium và Selenomonas lactilytica.
- Vi khuẩn phân giải protein: Trong số những loài vi khuẩn phân giải protein và sinh amoniac thì Peptostreptococus và Clostridium có khả năng lớn nhất. Sự phân giải protein và axit amin để sản sinh ra amoniac trong dạ cỏ có ý nghĩa quan trọng đặc biệt cả về phương diện tiết kiệm nitơ cũng như nguy cơ dư thừa amoniac. Amoniac cần cho các loài vi khuẩn dạ cỏ để tổng hợp nên sinh khối protein của bản thân chúng, đồng thời một số vi khuẩn đòi hỏi hay được kích thích bởi axit amin, peptit và isoaxit có nguồn gốc từ valine, leucine và isoleucine. Như vậy cần phải có một lượng protein được phân giải trong dạ cỏ để đáp ứng nhu cầu này của vi sinh vật dạ cỏ.
- Vi khuẩn sinh methane: Các loài vi khuẩn của nhóm này là Methano baccterium, Methano ruminantium và Methano forminicum.
- Vi khuẩn tổng hợp vitamin: Nhiều lồi vi khuẩn dạ cỏ có khả năng tổng hợp các vitamin nhóm B và vitamin K.
1.8.2. Động vật nguyên sinh (Protozoa)
Protozoa trong dạ cỏ thuộc lớp Ciliata có hai lớp phụ là Entodiniômrphidia và Holotrica. Phần lớn động vật nguyên sinh dạ cỏ thuộc nhóm Holotrica có đặc điểm là ở đường xoắn gần miệng có tiêm mao, cịn tất cả chỗ cịn lại của cơ thể có rất ít tiêm mao[14].
Protozoa có một số tác dụng chính như sau: - Tiêu hố tinh bột và đường.
- Tích luỹ polysaccarit.
- Bảo tồn mạch nối đôi của các axit béo không no.
1.8.3. Nấm (Fungi)
Nấm trong dạ cỏ thuộc loại yếm khí. Nấm là vi sinh vật đầu tiên xâm nhập và tiêu hoá thành phần cấu trúc thực vật bắt đầu từ bên trong. Những loài nấm được phân lập từ dạ cỏ cừu gồm: Neocallimastix frontalis, Piramonas communis và Sphaeromonas communis
[10].
Chức năng của nấm trong dạ cỏ là:
- Mọc chồi phá vỡ cấu trúc thành tế bào thực vật, làm giảm độ bền chặt của cấu trúc này, góp phần làm tăng sự phá vỡ các mảnh thức ăn trong quá trình nhai lại. Sự phá vỡ này tạo điều kiện cho bacteria và men của chúng bám vào cấu trúc tế bào và tiếp tục quá trình phân giải xenluloza.
- Mặt khác, nấm cũng tiết ra các loại men tiêu hoá xơ. Phức hợp men tiêu hố xơ của nấm dễ hồ tan hơn so với men của vi khuẩn. Chính vì thế nấm có khả năng tấn cơng các tiểu phần thức ăn cứng hơn và lên men chúng với tốc độ nhanh hơn so với vi khuẩn.
Như vậy sự có mặt của nấm giúp làm tăng tốc độ tiêu hố xơ. Điều này đặc biệt có ý nghĩa đối với việc tiêu hoá thức ăn xơ thơ bị lignin hố.
1.9. Một số nguồn cơ chất thuộc thế hệ 2
1.9.1. Bột bã sắn
Hiện nay, sắn được trồng trên 100 nước của vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và là nguồn thực phẩm của hơn 500 triệu người. Năm 2006 và 2007, sản lượng sắn thế giới đạt 226,34 triệu tấn củ tươi so với 2005/06 là 211,26 triệu tấn và 1961 là 71,26 triệu tấn. Nước có sản lượng sắn nhiều nhất là Nigeria (45,72 triệu tấn), kế đến là Thái Lan (22,58 triệu tấn) và Indonesia (19,92 triệu tấn). Nước có năng suất sắn cao nhất là Ấn Độ (31,43 tấn/ha), kế đến là Thái Lan (21,09 tấn/ha), so với năng suất sắn bình quân của thế giới là 12,16 tấn/ha (FAO, 2008). Việt Nam đứng thứ mười về sản lượng
sắn (7,71 triệu tấn) trên thế giới. Tại Việt Nam, sắn được canh tác phổ biến ở hầu hết các tỉnh của tám vùng sinh thái. Diện tích sắn trồng nhiều nhất ở Đơng Nam Bộ và Tây Nguyên [1].
Củ sắn tươi có tỷ lệ chất khơ 38-40%, tinh bột 16-32%; protein, chất béo, xơ, tro trong 100g được tương ứng là 0,8-2,5 g, 0,2-0,3 g, 1,1-1,7 g, 0,6-0,9 g; chất muối khoáng và vitamin trong 100 g củ sắn là 18,8-22,5 mg Ca, 22,5-25,4 mg P, 0,02 mg B1, 0,02 mg B2, 0,5 mg PP. Thành phần dinh dưỡng khác biệt tuỳ giống, vụ trồng, số tháng thu hoạch sau khi trồng và kỹ thuật phân tích [85].
Sắn có nhiều cơng dụng trong chế biến cơng nghiệp, thức ăn gia súc và lương thực thực phẩm. Củ sắn dùng để ăn tươi, làm thức ăn gia súc, chế biến sắn lát khô, bột sắn nghiền, tinh bột sắn, tinh bột sắn biến tính, các sản phẩm từ tinh bột sắn như bột ngọt, cồn, maltodextrin, lysine, acid citric, xiro glucose và đường glucose tinh thể, mạch nha giàu maltose, hồ vải, hồ giấy, colender, phủ giấy, bìa các tơng, bánh kẹo, mì ăn liền, bún, miến, mì ống, mì sợi, bột khoai, bánh tráng, hạt trân châu (tapioca), phụ gia thực phẩm, phụ gia dược phẩm, sản xuất màng phủ sinh học, chất giữ ẩm[1].
1.9.2. Bỗng rượu
Ở nước ta,nhiều địa phương có truyền thống nấu rượu. Việc nấu rượu theo cách thức cổ truyền đã tạo ra nguồn bỗng rượu phong phú. Đây là phụ phẩm được tạo ra từ quá trình chưng cất rượu sau khi lên men vi sinh vật và là một loại phụ phẩm rẻ tiền, sẵn có ở nơng hộ và có quanh năm, đồng thời các nghiên cứu cũng cho thấy bỗng rượu là một trong những nguồn phế phẩm nơng nghiệp có chứa hàm lượng dinh dưỡng cao. Từ xa xưa bỗng rưỡu đã được tận dụng làm thức ăn chăn nuôi và đã đem lại hiệu quả chăn nuôi cao [11].
Một vài nghiên cứu trong những năm gần đây đã cơng nhận bỗng rượu có thể được coi như là một nguồn cơ chất phù hợp để sản xuất khí biogas, thành phần khí biogas thu được từ bỗng rượu chứa khoảng 55-65% khí mê-tan, 30-45% carbon
dioxide, có sự xuất hiện của hydro. Sản lượng khí biogas thu được là 3476 cm3 / 100 g bỗng rượu sau 15 ngày. Tiềm năng lý thuyết của sản xuất khí mê-tan trên một tấn bỗng rượu ước tính là 98 Nm3 khí mê-tan [79].
Hình 1.4 cho thấy con đường lên men sản xuất hydro từ bỗng rượu bắt đầu từ sự lên men các axit béo của quá trình thủy phân tinh bột thành alcohol, do vậy bỗng rượu hồn tồn có thể trở thành một trong những nguồn cơ chất sản xuất hydro sinh học trong tương lai [15].
Hình 1.4: Sơ đồ phản ứng phân giải các hợp chất hữu cơ trong quá trình lên men rƣợu [15]
Độ pH bỗng rượu ở mức thấp và biến động từ 3,05-3,36. Protein và năng lượng của bỗng rượu đạt ở mức cao (28,18% và 4.866,67 kcal/kg DM– hàm lượng chất khơ tồn phần. Tỷ lệ NDF ( hàm lượng chất xơ trung tính) trung bình đạt ở mức cao 29,93% theo DM. Tỷ lệ axit lactic của bỗng rượu ở mức cao (2,31 g/100g chất tươi) và hàm lượng axit tổng số đạt trung bình là 17,39 g/kg chất tươi. Hàm lượng Ca, P của
bỗng rượu là thấp, biến động từ 0,1 đến 0,32% và 0,3 đến 0,96% DM. Kết quả về thành phần hóa học một số chỉ tiêu của bã rượu trong nghiên cứu này (DM, protein, khoáng tổng số, NDF, năng lượng thô) tương đối cao (9,10%; 23,10%; 4,7%; 15,40%; 4.777 kcal/kg, tương ứng), và một số chỉ tiêu lipit, canxi, phospho tương ứng là 9,90%; 0,55%, 0,35% DM. Sự khác nhau này có thể do loại gạo, men, dụng cụ, phương pháp chưng cất rượu [6]
Với những giá trị dinh dưỡng và lợi ích về mặt kinh tế bỗng rượu là một nguồn nguyên liệu đầu vào thích hợp cho việc sản xuất hydro sinh học với giá thành rất rẻ, có thể lên men sản xuất trên quy mô công nghiệp bởi đây là nguồn nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm.
CHƢƠNG 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. Nguyên liệu và thiết bị
2.1.1. Nguyên liệu
- Mẫu dạ dày bò được lấy tại lò giết mổ tư nhân tại huyện Quốc Oai, Thành phố Hà Nội.
- Mẫu được lấy ngay sau khi giết mổ và bảo quản lạnh.
- Chủng Clostridium beijerinckii NBRC109359 được mua tại Ngân hàng gen của NITE Nhật Bản.
2.1.2. Thiết bị
- Bể lắc ổn nhiệt (water shaking bath; Model: WSB – 30; Serial no: 0398272117PO10; Hàn Quốc).
- Máy sắc kí khí (Gas Chromatography – GC; 7890A; serial #: us11501033 - USA) để đo lượng khí H2 sinh ra. Máy soi và chụp ảnh gel GelDoc (BioRad, Mỹ).
- Bình khí N2 pure và dây dẫn khí để tạo mơi trường kị khí (Model: Tornado LS/B – He; Vietnam).
- Cân điện tử để xác định trọng lượng các thành phần của môi trường (Model: precisa 310M; Thụy Sỹ).
- Máy ly tâm lạnh (Eppendorf, Đức); máy PCR (Mastercycler, Eppendorf, Đức), hệ thống điện di gel agarose (NixTechnik, Pháp); Kính hiển vi quang học Olimpus (Nhật).
- Box cấy kị khí (Model: Whitley VA 500 workstation, Anh), tủ ổn nhiệt (Imperial III).
- Máy đo OD để xác định khả năng sinh trưởng của vi sinh vật (Model: Biomate 3; serial no: 2KBK 138001; Mỹ).
2.1.3. Dụng cụ
- Bình serum 15 mL, 100 mL, nắp cao su và nắp nhôm, kim tiêm để nuôi cấy kị khí. Gas-tight syringe (P/N 008160; 1MR-VLL-GT; C04-A1831 –Australia) để lấy mẫu khí cho GC, dụng cụ kẹp nắp nhôm (Handy crimper for aluminum seal), pipet, đầu cơn, đĩa petri, ống eppendorf, ống falcol, bình tam giác, ống đong, ống nghiệm…
2.2. Môi trƣờng
Trong nghiên cứu này, môi trường nuôi cấy được chuẩn bị cho phương pháp lên men theo mẻ (batch fermentation) dưới điều kiện kị khí [93].
- Danh mục hóa chất, xuất xứ Pepton: Merck Glucose: Merck KH2PO4: Merck NaHCO3: Merck K2HPO4: Merck Reazurin: Sigma Và một số hóa chất thơng dụng khác
Cao nấm men: Merck NaCl: Merck CaCl2.6H2O: Merck MgSO4: Merck Agar : Merck DNS : Trung Quốc 2.2.1. Môi trường PY (1000mL)
Sử dụng để làm giàu và phân lập vi khuẩn sinh hydro
Peptone: 10 g Yeast extract: 10 g Glucose: 10 g Reazurine: 1mg Salt solution: 40 mL H2O 960 mL ;pH = 5,0
100 mL salt solution gồm: KH2PO4: 0,1 g K2HPO4: 0,1 g NaHCO3: 1 g NaCl: 0,2 g CaCl2: 0,02 g MgSO4: 0,02 g pH = 6,5