lên sản lượng hydro, phương pháp tối ưu đáp ứng bề mặt, sử dụng quy hoạch thực nghiệm Box–Behnken design và phần mềm DX7.1.5 được sử dụng để tối ưu hóa các điều kiện lên men làm tăng sản lượng hydro sinh ra [61, 88].
Các nghiên cứu trước đây đã chứng minh rằng sản lượng hydro chịu tác động mạnh mẽ nhất bởi 3 yếu tố: hàm lượng cơ chất, thời gian, nhiệt độ [43, 47, 71, 81]. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của hàm lượngcơ chất cho thấy sucrose là nguồn cơ chất cho ra sản lượng cao nhất, vì vậy sucrose được chọn làm nguồn cơ chất để tiền hành tối ưu. Để tối ưu hóa các thơng số này các biến được lựa chọn và chạy như sau:
Hàm lượng sucrose: 5 - 15 g/L (X1); Thời gian: 24 – 72 giờ (X2); Nhiệt độ: 30 - 45°C (X3).
Kết quả thực nghiệm với 17 thí nghiệm để tối ưu sản lượng hydro thể hiện trong Bảng 3.6.
Bảng 3.6: Ma trận thực nghiệm và kết quả lên men kết hợp 3 chủng Clostridium sp. sp. STT X1 X2 X3 Sản lượng H2 (l/L) STT X1 X2 X3 Sản lượng H2 (l/L) 1 5 24 37,5 0,61 10 10 72 30 0,82 2 15 24 37,5 0,79 11 10 24 45 0,48 3 5 72 37,5 0,75 12 10 72 45 0,51 4 15 72 37,5 0,89 13 10 48 37,5 1,12 5 5 48 30 0,67 14 10 48 37,5 1,09 6 15 48 30 0,86 15 10 48 37,5 1,11 7 5 48 45 0,51 16 10 48 37,5 1,12 8 15 48 45 0,58 17 10 48 37,5 1,08 9 10 24 30 0,56
Kết quả thực nghiệm ( Bảng 3.6 ) cho thấy sản lượng hydro đạt cao nhất 1,13 l/L mơi trường ở thí nghiệm thứ 13 với 10 g/L sucrose; 48 giờ ; tốc nhiệt độ 37,5°C và sản lượng hydro thấp nhất đạt 0,48 l/L mơi trường ở thí nghiệm 11 với 10 g/L sucose;
24 giờ; nhiệt độ 30°C. Phương pháp hàm mong đợi cho phép đánh giá sự tác động đồng thời của các yếu tố đến kết quả, dựa trên sự phân tích hồi quy đa điểm từ đó tìm ra được một phương án có thể thu được kết quả cao nhất. Do vậy, các phương án theo ma trận và kết quả thu được trên thực nghiệm sẽ được phân tích theo phương sai Anova của mơ hình như Bảng 3.7.
Bảng 3.7: Phƣơng sai Anova của mơ hình
Thơng số Phƣơng sai Chuẩn F Giá trị p
(Khả năng > F) Mơ hình 0,91 293,95 < 0,0001 X1 0,042 122,90 < 0,0001 X2 0,035 102,63 < 0,0001 X3 0,086 251,69 < 0,0001 X1X2 4,000E-004 1,17 0,3154 X1X3 3,600E-003 10,52 0,0142 X2X3 0,013 38,65 0,0004 X12 0,083 243,80 < 0,0001 X22 0,17 508,38 < 0,0001 X32 0,40 1169,32 < 0,0001
Lack of fit 1,075E-003 1,09 0,4507
Phương sai Anova của mơ hình cho phép kiểm tra sự có nghĩa của các hệ số và sự thích ứng của mơ hình được tiến hành bằng phân tích hồi quy (Bảng 3.7). Chuẩn F của mơ hình bằng 201,79 cho thấy mơ hình hồn tồn có ý nghĩa thống kê, với độ tin cậy 99,99% (p < 0,0001). Sự có nghĩa của các hệ số hồi quy được kiểm định bởi chuẩn F, các giá trị p < 0,05 cho biết các hệ số hồi quy đều có nghĩa.
Chuẩn F của mơ hình có giá trị khơng tương thích là 1,09 (p = 0,4507), qua đó cho thấy mơ hình hồn tồn tương thích với thực nghiệm. Ngồi ra, giá trị p của sự tác động đồng thời của hàm lượng sucrose và nhiệt độ cũng như thời gian và nhiệt độ cho
thấy sự ảnh hưởng mạnh mẽ tới sản lượng hydro khi lên men kết hợp 3 chủng
Clostridium phân lập.
Từ đó, thiết lập được phương trình hồi quy như sau: Với Y: hàm sản lượng hydro.
Y= 1,10 + 0,072X1 + 0,066X2 – 0,10X3 – 0,010X1X2 – 0,030X1X3 – 0,057X2X3 – 0,14X12 – 0,20X22 - 0,31X32
Hình 3.7: Hồi quy đáp ứng ảnh hƣởng các yếu tố đến sản lƣợng hydro
(A): Cố định nhiệt độ, thay đổi thời gian và hàm lượng sucrose. (B): Cố định thời gian, thay hàm lượng sucrose và nhiệt độ. (C): Cố định hàm lượng sucrose, thay đổi nhiệt độ và thời gian.
Xây dựng các đồ thị biểu thị mối tương quan giữa các yếu tố thí nghiệm và kết quả thu được. Qua đó cho thấy, sản lượng hydro tăng dần từ màu xanh đến màu vàng và màu đỏ biểu thị mật độ tế bào cao nhất (Hình 3.7).
Hình 3.7 cho thấy, cả ba yếu tố: hàm lượng sucrose, thời gian và nhiệt độ đều có tác động đến sản lượng hydro. Trong đó, Hàm lượng sucrose có tác động lớn nhất (sản lượng thay đổi rất rõ rệt khi hàm lượng sucrose tăng hoặc giảm), sau đó đến thời gian và nhiệt độ có tác động ít nhất.
Kết quả tối ưu hóa bằng phần mềm và dựa vào phường trình hồi quy sản lượng hydro như sau:
- Hàm lượng sucrose : 11,63 g/L; thời gian 51,13 giờ; nhiệt độ 36,09°C. Sản lượng hydro đạt: 1,13 L/L mơi trường
Nhằm kiểm tra tính đúng đắn của mơ hình, thí nghiệm lên men theo các điều kiện tối ưu mơ hình đưa ra (hàm lượng sucrose : 11,63g/L; thời gian 51,13h; nhiệt độ 36,09°C) được lặp lại, kết quả sản lượng hydro đạt 1,129 mL/L. Như vậy, sản lượng hydro lý thuyết và thực nghiệm chênh lệch trong giới hạn cho phép, nên xác định rằng mơ hình thống nhất với thực nghiệm.
3.4. Khảo sát khả năng sinh khí hydro của các chủng Clostridium sp. trên một số
nguồn cơ chất thuộc thế hệ thứ 2
3.4.1. Khả năng sinh hydro khi lên men với bột bã sắn
Trong bột bã sắn có rất nhiều chất dinh dưỡng đặc biệt là nguồn carbonhydrate chiếm tới 9,6 g/L. Có thể nói bột sắn là một nguồn phế phẩm nơng nghiệp giàu dinh dưỡng nhưng lại đem lại hiệu quả kinh tế cao khi áp dụng vào quá trình lên men sản xuất hydro.
Hình 3.8 thể hiện kết quả lên men bột sắn với các chủng Clostridium sp.. Khả năng sinh hydro cao nhất là khi lên men chủng C. butyricum ST5, với sản lượng thu
được là khoảng 895,2 ± 5,6 mL/L, chiếm 59,2 % tổng thể tích khí sinh ra (Phụ lục 3), cao hơn khoảng 1,3 lần so với chủng đối chứng là C. beijerinckii NBRC 109359
(658,34 ± 14,38 mL/L). Có thể lý giải là do khả năng phân giải tinh bột và cellulose của chủng C. butyricum ST5 cao hơn so với C. beijerinckii ST1 và C. bifermentans
ST4. Tuy sản lượng hydro khi lên men với cơ chất bột sắn của 2 chủng C. beijerinckii ST1 và C. bifermentas ST4 có thấp hơn so với sản lượng của chủng C. butyricum ST5 nhưng không đáng kể là 805,8 ± 11,5 mL/L và 787,5 ± 9,2 mL/L, theo thứ tự. Hình 3.8 cho thấy sản lượng hydro thu được từ các chủng phân lập được cao hơn so với chủng
C. beijerinckii đối chứng.
Hình 3.8: Kết quả lên men các chủng Clostridium sp. với bột sắn
Khi lên men kết hợp 2 chủng Clostridium sp. với bột sắn, sản lượng hydro thu được giảm đi từ 1,7 – 3,6 lần so với khi lên men chủng C. butyricum ST5. Sản lượng hydro chỉ đạt từ 248,5 ± 6,8 mL/L đến 529,6 ± 8,7 mL/L khi nuôi kết hợp lần lượt chủng C. beijerinckii ST1 với C. bifermentans ST4 và C. butyricum ST5 với C.
0 658,34 895,2 805,8 787,5 529,6 403,8 248,5 635,9 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 S ản lƣợn g H 2 (m L /L ) Chủng lên men
beijerinckii ST4. Sản lượng hydro khi lên men kết hợp cả 3 chủng Clostridium sp. là
635,9 ± 7,5 mL/L thấp hơn so với sản lượng hydro khi lên men đơn chủng, sản lượng hydro. Kết quả này có thể giải thích là do với nguồn cơ chất giàu tinh bột như bột sắn thì khi lên men kết hợp các chủng Clostridium sp. có khả năng phân giải tinh bột như vậy thì các chủng vi sinh vật có sự cạnh tranh về nguồn thức ăn nên khả năng chuyển hóa tinh bột thành hydro của các chủng bị giảm đi, đặc biệt là với 2 chủng C. beijerinckii ST1 và C. bifermentas ST4, sản lượng hydro thu được chỉ đạt 248,5 ± 6,8
mL/L.
Với nguồn cơ chất giàu dinh dưỡng và đầy tiềm năng để sản xuất hydro như bột sắn thì trên thế giới cũng đã có những nghiên cứu tương tự để sản xuất hydro sinh học từ bột sắn như nghiên cứu của Shing – Der C. và cộng sự [75], sản lượng hydro thu được khi lên men chủng C. butyricum CGS2 đạt mức 12,52 – 9,9 mmol/g tinh bột,
Bianca Martins C. và cộng sự cũng thu được sản lượng hydro từ 418 – 505 mL/L với nguồn cơ chất là bột sắn [21] khi lên men chủng C. acetobutylicum. Ngoài bột sắn,
Yokoi và cộng sự cũng thu được sản lượng hydro tối đa là 2,4 mol/mol glucose khi lên men chủng C. butyricum và E. aerogenes với nguồn cơ chất là bột khoai tây phế liệu
[92]. Akutsu và cộng sự cũng thu được sản lượng hydro tối đa là 2,82 mol/mol glucose khi sử dụng nguồn cơ chất là tinh bột hàm lượng 20g/L , tuy nhiên sản lượng này giảm khi nồng độ cơ chất là 30g/L [17]. Sompong và cộng sự cũng thu được sản lượng tối đa là 240, 224.4 và 165.2 mL H2/g bột sắn theo thứ tự khi nuôi cấy hỗn hợp các chủng vi sinh vật ưa ấm từ các suối nước nóng Klong Pai Poo thuộc thị trấn Phangnga, Wat Than Nam Ron thuộc thị trấn Suratthani, Romani thuộc thị trấn Phangnga Thái Lan [80].Ngoài ra, Su và cộng sự cũng thu được sản lượng hydro là 979,9 – 2541,1 mL/L với hàm lượng bột sắn từ 10-25 g/L [82].
3.4.2. Sản lượng hydro với nguồn cơ chất là bỗng rượu
Bỗng rượu hay bã rượu là sản phẩm sau quá trình thủy phân tinh bột thành rượu, do đó thành phần chủ yếu của bỗng rượu là các amino axit, các axit béo và đường, các axit này sau quá trình lên men nhờ sự phân giải của các vi sinh vật sẽ tạo ra hydro, CO2, acetat [26]. Tuy nhiên, để lên men bỗng rượu sản xuất hydro từ các chủng Clostridium sp. thì việc tiền xử lý đóng vai trị cực kỳ quan trọng [16, 22], việc điều chỉnh pH từ 3 – 3.5 về mức pH 6.0 – 7.0 là yếu tố quyết định bởi các chủng Clostridium sp. hoạt động phân giải tạo hydro tốt nhất ở mức pH 6.0 – 7.0 [15, 36, 53].
Hình 3.9: Kết quả lên men các chủng Clostridium sp. với bỗng rƣợu
Hình 3.9 cho thấy với nguồn cơ chất là bỗng rượu thì chủng C. bifermentans ST4 cho ra sản lượng hydro là 765,05 ± 8,6 mL/L cao hơn so với C. beijerinckii ST1 (689.775 ± 11,5 mL/L) và C. butyricum ST5 (636,98 ± 8,6 mL/L). Đồng thời, sản lượng hydro của các chủng phân lập vẫn cao hơn so với chủng Clostridium beijerinckii NBRC 109359 (458,8 ± 7,26 mL/L). 0 458,8 636,975689,775 767,05 658,35 809,25 139,5 959 0 200 400 600 800 1000 1200 sản lƣợng H2 (m L /L ) Chủng lên men
Khi lên men kết hợp 2 chủng Clostridium với bỗng rượu, sản lượng hydro cao nhất thu được là ở mơ hình lên men kết hợp 2 chủng C. butyricum ST5 và C. bifermentans ST4, sản lượng hydro đạt 809,25 ± 7,9 mL/L, cao hơn so với khi lên men
đơn chủng. Khi lên men kết hợp 2 chủng C. beijerinckii ST1 và C. bifermentans ST4
thu được sản lượng hydro rất thấp, chỉ đạt 139,5 ± 2,5 mL/L. Điều này được lý giải là do khi kết hợp 2 chủng C. beijerinckii ST1 và C. bifermentans ST4 trong mơi trường bỗng rượu thì các hợp chất hữu cơ có thể được phận giải thành acetate, butyric,… (Hình 1.4),. Sản lượng hydro thu được khi lên men kết hợp C. butyricum ST5 và C. beijerinckii ST1 đạt 658,35 ± 9,4 mL/L, kết quả này gần với kết quả khi lên men 2
chủng riêng biệt, điều này cho thấy khi lên men kết hợp 2 chủng C. butyricum ST5 và
C. beijerinckii ST1 thì 2 chủng này khơng ức chế mà cũng khơng hỗ trợ cho nhau trong
q trình phân giải tạo hydro.
Khi tiến hành thí nghiệm lên men kết hợp cả 3 chủng C. beijerinckii ST1 C. bifermentans ST4 và C. butyricum ST5 trong bỗng rượu thu được sản lượng hydro cao
nhất, phần trăm khí hydro là 54,5% ( Phụ lục 3), sản lượng hydro đạt 959 ± 8,8 mL/L. Kết quả này có thể giải thích là do khi lên men kết hợp cả 3 chủng ST1, ST4 và ST5 trong bỗng rượu thì cả 3 chủng hoạt động hỗ trợ cho nhau để chuyển hóa các axit béo, amino axit, đường tạo thành hydro (Hình 1.4). Đây là kết quả vơ cùng có ý nghĩa và khả quan khi có thể sử dụng một nguồn nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm như bỗng rượu để sản xuất hydro trên quy mô công nghiệp.
KẾT LUẬN
- Đã phân lập, định danh 4 chủng có khả năng sinh khí hydro là: C. beijerinckii ST1,
C. bifermentans ST4, C. butyricum ST5, Enterobacter cloacae ST8.
- Tuyển chọn được nguồn cơ chất phù hợp nhất đối với từng chủng Clostridium sp.: chủng C. beijerinckii ST1 phù hợp với nguồn cơ chất là glucose, 2 chủng còn lại là
C. bifermentans ST4 và C. butyricum ST5 phù hợp với nguồn cơ chất là sucrose.
- Tìm hiểu q trình ni cấy kết hợp giữa các chủng vi sinh vật làm tăng hiệu quả sản xuất hydro.
- Tối ưu hóa được các điều kiện lên men để thu được sản lượng hydro tối đa cho mơ hình lên men kết hợp 3 chủng, sản lượng hydro cao nhất thu được là 1,13 l/L ở điều kiện tối ưu: Hàm lượng sucrose : 11,63 g/L; thời gian 51,13 giờ; nhiệt độ 36,09°C - Bước đầu tìm hiểu một số nguồn cơ chất thuộc thế hệ thứ 2 là bột sắn, bỗng
rượu…làm nguyên liệu đầu vào cho quá trình lên men sản xuất hydro sinh học. Sản lượng hydro tối đa đạt được lần lượt là 895,2 ± 5,6 mL/L và 959 ± 8,8 mL/L từ các nguồn cơ chất tương ứng.
KIẾN NGHỊ
- Phát triển quy mơ ni cấy lớn hơn để tìm hiểu khả năng sinh hydro và có những ứng dụng thiết thực trên quy mơ cơng nghiệp.
- Tiếp tục tìm hiểu nghiên cứu thêm những nguồn cơ chất thế hệ thứ hai (bã mía, lõi ngơ, rơm rạ, vỏ khoai tây, các phế phẩm cấy dứa,…) để có thêm lợi ích về mặt kinh tế.
- Nghiên cứu các phương thức thu hồi hydro từ hỗn hợp khí tạo ra sau q trình lên men…
- Tiếp tục nghiên cứu q trình ni cấy kết hợp các chủng vi sinh vật nhằm nâng cao hiệu suất sinh hydro.
- Tiếp tục quá trình phân lập để tìm ra những chủng khác có khả năng sản xuất hydro ở các nguồn khác nhau. Tạo nên tính đa dạng và phong phú cho các chủng vi sinh vật có khả năng lên men sản xuất hydro.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Hoàng Kim Anh (2005), Tinh bột sắn và các sản phẩm từ tinh bột sắn, Khoa học Kỹ thuật.
2. Nguyễn Tuấn Anh (2009), Nghiên cứu, tổng hợp ống than nano nhằm ứng dụng
trong pin nhiên liệu dùng Methanol trực tiếp (DMFC), Đại học quốc gia Hà
Nội.
3. Nguyễn Lân Dũng và cộng sự. (1972), "Một số phương pháp nghiên cứu Vi sinh vật học", Tập. 1, Tr. 328-345.
4. Nguyễn Lân Dũng, "Nguyễn Đình Quyến và Phạm Văn Ty, 2000", Vi sinh vật
học đại cương. Nhà xuất bản Giáo dục Hà Nội. 208.
5. Đặng Minh Đức (2011), Cộng đồng các quốc gia độc lập (SNG) những vấn đề
chính trị-kinh tế nổi bật, Khoa học xã hội.
6. Bùi Thị Thu Hằng (2015), Nghiên cứu xử lý bã rượu từ nhà máy sản xuất cồn
để sản xuất nguyên liệu thức ăn chăn nuôi, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội.
7. Nguyễn Thu Hoài (2015), Nghiên cứu vi sinh vật sinh Methane ứng dụng cho sản xuất Biogas trong điều kiện môi trường nước lợ và nước mặn, Đại học Quốc
gia Hà Nội.
8. Nguyễn Hồi Hương (2009), Giáo trình Thực hành hóa sinh, Trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh.
9. Nguyễn Minh Mẫn (2013), "Chính sách an ninh năng lượng Trung Quốc đầu thế kỉ XXI và vấn đề tranh chấp chủ quyền ở biển Đơng", Tạp chí Khoa học(46),
10. Nguyễn Thanh Nhàn (2015), Ảnh hưởng của nguyên liệu thức ăn đến sinh khí methane và số lượng vi sinh vật dạ cỏ bị invitro, Trường Đại học Nơng Lâm
TP. Hồ Chí Minh.
11. Nguyễn Cơng nh , et al. (2016), "Đánh giá tiềm năng bã rượu làm thức ăn chăn nuôi lợn nông hộ tại ba tỉnh phía Bắc", Journal of Science and Development. 14(1), Tr. 79-86.
12. Võ Văn Phước Quệ and Cao Ngọc Điệp (2011), "Phân lập và nhận diện vi khuẩn phân giải cellulose , Xuất bản-Tạp chí-Trường Đại Học Cần Thơ", Tạp