2.3.1. Phương pháp xử lý mẫu và nuôi cấy
- Các mẫu thu thập được pha loãng trong nước cất, tiền xử lý mẫu bằng máy gia nhiệt ở 1000 C trong 30 phút [28].
- 8mL môi trường sẽ được cho vào bình serum 15mL sau đó được đóng nắp cao su và nắp nhôm bên ngồi.
- Headspace của bình serum được sục khí N2 tinh khiết để loại bỏ hết O2 trong bình nhằm tạo mơi trường kị khí. Khi mơi trường trở lên trong suốt và lắc lên khơng
• Thu mẫu dạ dày bị tại Huyện Quốc Oai, Tp. Hà Nội
Thu mẫu
• Ni cấy mẫu trong bình serum, xác định lượng hydro sinh ra từ mỗi mẫu, chọn các mẫu cho sản lượng hydro cao (ml/L mơi trường)
Làm giàu và thử sinh hydro
• Phân lập các vi sinh vật kị khí sinh hydro trong mẫu được chọn và định danh bằng khóa định loại Bergey kết hợp kĩ thuật sinh học phân tử Phân lập và định danh
• So sánh sản lượng hydro của các chủng phân lập được với một số chủng Clostridium khác
So sánh sản lượng hydro
• Khảo sát khả năng sinh hydro trên một số nguồn cơ chất được thực hiện với mơ hình lên men đơn chủng và lên men kết hợp
Khảo sát khả năng sinh hydro trên một số nguồn cơ
chất có sẵn
• Sử dụng phần mềm DX7.1.5 và mơ hình thí nghiệm của Box-Behnken để tối ưu hóa điều kiện lên men làm tăng sản lượng hydro
Tối ưu hóa điều kiện lên men bằng phương pháp đáp
ứng bề mặt
• Nghiên cứu khả năng sinh khí hydro khi lên men với nguồn cơ chất là bột bã sắn và bỗng rượu.
Khả sát khả năng sinh khí hydro trên một số nguồn cơ
còn thấy hiện tượng chuyển sang màu hồng của thuốc thử thì mơi trường đã sẵn sàng cho việc làm giàu chủng.
Hình 2.2: Phƣơng pháp sục khí nitơ
- Cấy giống từ 5-10% (v/v) khi vẫn đang tiến hành sục khí N2.
- Cuối cùng cho bình serum đã cấy vào bể lắc ổn nhiệt và nuôi cấy ở 37oC, 200 rpm.
- Sau 2 ngày ni cấy chọn những mẫu có khả năng sinh khí hydro cao cấy chuyển sang bình làm giàu lần thứ hai và thứ ba để phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo.
- Lấy dịch ni cấy lần thứ 3 pha lỗng, cấy trải trên đĩa thạch mơi trường PYA, PYGA trong tủ ni cấy kị khí.
- Sau 24- 48 giờ, quan sát và lựa chọn những khuẩn lạc to, riêng rẽ nuôi lại kiểm tra khả năng sinh H2.
- Từ các đĩa Petri chọn ra các khuẩn lạc riêng rẽ dựa vào đặc điểm khác nhau về hình dáng, kích thước, màu sắc, bề mặt, mép, độ lồi. Sau đó chúng tơi đã ni thuần chủng tinh khiết và giữ giống phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo.
Các chủng thuần khiết phân lập được sẽ được thử nghiệm về hình thái, tính chất sinh lý, sinh hóa. Mặc dù phương pháp này khơng hồn tồn chính xác nhưng đây là bước đầu tiên trong nghiên cứu phân loại vi sinh vật. Các thí nghiệm được thực hiện như sau [3]:
2.3.2. Định danh vi khuẩn theo khóa định loại Bergey [3,4,64]
Định danh theo khóa định loại Bergey là phương pháp định danh dựa vào một số đặc điểm hình thái và một số đặc tính sinh lý, sinh hóa đặc trưng của vi sinh vật. Một số các đặc điểm đặc trưng để phân loại theo khóa Bergey là:
Nhuộm Gram
Khả năng sinh bào tử
Thử nghiệm Catalase [3, 4]
Thử nghiệm khả năng di động
Thủy phân gelatin
Thử nghiệm Indole
Thử nghiệm hoạt tính Lecithinase
Thử nghiệm Urease
Đồng hóa Citrate
Thử nghiệm Oxidase
Thử nghiệm Methyl red (MR)
Thử nghiệm VP
2.3.3. Định danh chủng sinh khí hydro dựa vào giải trình tự đoạn gen 16S rRNA
Tách chiết và tinh sạch DNA
Tách chiết và tinh sạch DNA sử dụng bộ kit “Magpure Bacteria DNA Kit” của ANABIO Research & Development. Kiểm tra chất lượng DNA là bước cần thiết trong
quy trình tách chiết DNA, DNA tinh sạch được phân tích bằng cách điện di trên gel agarose 1%, nhuộm bởi EtBr và được quan sát bằng ánh sáng UV.
PCR khuếch đại đoạn 16S rDNA
Sau khi tinh sạch genome, đoạn gen mã hóa 16S rRNA được khuếch đại bằng cặp mồi 27F và 1527R. 27F 1527R 5’-AGAGTTTGATAMTGGCTCAG-3’ 5’-AAAGGAGGTGATCCAGCC-3’ Thành phần PCR (tổng thể tích 30µl/phản ứng): 10x buffer: ADN mẫu (100- 200 ng/µl: 27Fw (10 pmol): 1527Rv (10 pmol): dNTP: H2O: 3 µl 4 µl 1,5 µl 1,5 µl 3 µl 16,3 µl
Chu trình nhiệt cho PCR:
94°C 5 phút 94°C 30 giây 62°C 45 giây 72°C 90 giây 72°C 5 phút 4°C ∞
Sản phẩm sau PCR được điện di kiểm tra bằng gel agarrose 1%, so sánh với DNA laSTer 1kb, nhuộm bởi EtBr và được quan sát bằng ánh sáng UV.
Tinh sạch sản phẩm PCR:
Sản phẩm PCR được tinh sạch theo bộ kit “Anapure PCR product” của ANABIO R & D. Sản phẩm PCR tinh sạch được điện di kiểm tra bằng gel agarose 1%,
nhuộm bởi EtBr và quan sát bằng ánh sáng UV. Băng có kích thước khoảng 1500bp là sản phẩm tương ứng với vùng trình tự của rDNA ở vi khuẩn.
Giải trình tự sản phẩm PCR và phân tích dữ liệu:
Các mẫu DNA tinh sạch từ sản phẩm PCR được giải trình tự. Các trình tự DNA sau đó được phân tích bằng phần mềm Chromas và DNA club, sau đó so sánh với dữ liệu có sẵn trong Ngân hàng gen của NCBI (GenBank) sử dụng chương trình BLAST nhằm tìm ra chủng có trình tự gần nhất với tỷ lệ tương đồng tương ứng, tên chủng vi khuẩn được đặt tên, định danh dựa vào kết quả BLAST. Các dữ liệu liên quan được trích xuất ở dạng FASTA để phục vụ cho phân tích phát sinh chủng loại.
2.3.4. Xác định hoạt tính enzyme của các chủng Clostridium sp.
Mục đích: Xác định khả năng phân giải một số enzyme ngoại bào của các
chủng Clostridium sp. như casein, cellulose, amylase. Từ đó tìm ra một số nguồn cơ
chất phù hợp để tiến hành len men tối sản xuất hydro.
Phƣơng pháp:
Vi sinh vật được lên men trong các môi trường lỏng có chứa 10% cơ chất là CMC, casein, tinh bột tan ở nhiệt độ 37°C trong 48 giờ. Sau đó, dịch huyền phù vi sinh vật đem ly tâm ở 7000 rpm trong 2 phút.
Cho 100μl dịch ly tâm vào các giếng thạch chứa 0,1% enzyme tương ứng. Đặt đĩa thạch vào tủ lạnh 4°C trong 3 tiếng để dịch ly tâm khuếch tán đều quanh giếng thạch. Sau đó, đặt đĩa thạch vào tủ ấm 37°C trong 24h.
Sau 24h, nhuộm các đĩa thạch bằng Lugol 5%. Kết quả, nếu xuất hiện vòng tròn phân giải xung quanh giếng thạch chứng tỏ vi sinh vật có khả năng phân giải enzyme ngoại bào.
2.4. Các phƣơng pháp phân tích
2.4.1. Xác định tổng khí biogas sinh ra
Tổng lượng khí sinh ra được xác định theo phương pháp thay thế nước (water displacement method) [84] (Hình 2.3), theo đó khí trong bình thí nghiệm sẽ theo đường dẫn số 6 vào trong ống đong và đẩy dần nước ra khỏi ống, lượng nước bị đẩy ra khỏi ống đong tương đương với lượng khí sinh ra trong bình phân hủy kỵ khí [7].
Hình 2.3: Ngun lý của phƣơng pháp cột nƣớc xác định tổng lƣợng khí sinh ra từ bể phân hủy kỵ khí (Lettinga, 1995).
Chú thích:
1 - Bình phân hủy kỵ khí 2- Đường lấy mẫu phân tích
3 - Xylanh có khóa lấy khí phân tích H2 4 - Khóa đóng mở
5 - Ống đong đo cột nước
6 - Ống dẫn khí để xác định tổng lượng khí sinh ra qua sự chuyển động của cột nước [7]
2.4.2. Xác định hàm lượng đường khử bằng phương pháp DNS
Hàm lượng đường khử được xác đinh bằng phương pháp DNS [8]. Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử acid dinitrosalicylic (DNS). Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định. So màu tiến hành ở bước sóng 540nm.
Cho 1 mL dung dịch vào ống nghiệm, thêm 3 mL DNS, đun sôi 5 phút. Sau khi để nguội đo mật độ quang (OD). Thực hiện tương tự với dung dịch glucose 10 mg/mL để xây dựng đường chuẩn glucose, với hàm lượng glucose lần lượt là 0,02; 0,04; 0,06; 0,08; 1 mg/mL. Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử DNS sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu (Phụ lục 3).
Kết quả xây dựng đường chuẩn cho phương trình y = 1,406x +0,130 với hệ số tương quan R2 = 0,999. Từ đó tính được hàm lượng glucose còn lại và glucose tiêu thụ cũng như sản lượng hydro của các chủng. Kết quả này được sử dụng để so sánh với một số kết quả đã được cơng bố trước đó.
2.4.3. Định lượng khí hydro trong mơ hình thí nghiệm
Thành phần khí được xác định trên máy sắc ký GC-8A (SHIMADZU) với khí mang là Argon, detector TCD, cột thép (3mm, dài 2m, nhồi vật liệu Unibeads C có kích thước hạt 60/80mesh). Quy trình phân tích: nhiệt độ injector và detector là 150 oC, nhiệt độ lò là 145 oC, áp suất khí mang là 80 kPa, thời gian phân tích 10 phút/mẫu. Mẫu khí được lấy bằng xilanh (VICI precision sampling, Inc., Baton Rouge., LA,USA) với thể tích là 0,5 mL.
Trước khi bơm vào máy sắc ký mẫu khí được đẩy ra khỏi xilanh để chỉ 0,2 mL hỗn hợp khí được phân tích. Thể tích mỗi khí tỷlệ thuận với diện tích pic khí đó và được xác định thơng qua đường chuẩn xây dựng giữa thể tích khí chuẩn và diện tích pic.
Cách xây dựng đường chuẩn: Mỗi loại khí được lần lượt lấy các thể tích: 0,1; 0,2; 0,3; 0,5 và 1,0 mL và được bơm vào máy sắc ký GC-8A. Sau đó lập đường chuẩn giữa thể tích khí và diện tích pic tương ứng.
- Xác định hàm lượng khí hydro sinh ra
YH2 = A.V (mL/L), với A là phần trăm khí hydro, V là tổng thể tích khí sinh ra). - Sản lượng hydro được tính theo cơng thức:
YH2 = 𝑚𝑜𝑙𝐻2 𝑡ạ𝑜 𝑟𝑎
𝑚𝑜𝑙𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑒 𝑡𝑖 ê𝑢 𝑡ℎ ụ (𝑚𝑜𝑙 𝑚𝑜𝑙)
Trong đó: mol H2 tạo ra = 𝐻à𝑚𝑙 ượ𝑛𝑔𝐻2 sinh 𝑟𝑎 𝑅.𝑇
𝑅:ℎằ𝑛𝑔 𝑠ố 0.082
𝑇:298 𝑡ℎ𝑒𝑜 𝑛ℎ𝑖ệ𝑡 độ 𝐶𝑎𝑙𝑣𝑖𝑛 [62]
Lượng glucose tiêu thụ được tính tốn theo phương pháp định lượng đường khử bằng DNS[8], hàm lượng glucose được tính dựa theo phương trình đường chuẩn được xây dựng bằng phần mềm excel y = ax + b, với hệ số tương quan R có ý nghĩa.
- Xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn bằng đo mật độ quang tế bào bằng phương pháp quang phổ bước sóng (opical density –OD600) đo bằng máy đo OD .
2.4.4. Xác định thành phần cơ chất thế hệ 2
Xác định thành phần giá trị dinh dưỡng của các nguồn cơ chất thế hệ 2 theo các chỉ tiêu:
Chất rắn lơ lửng : xác định theo TCVN 6625-2000 Chất rắn hòa tan : xác định theo SMEWW2540.C:2012 Tổng carbonhydrat : xác định theo TCVN_7033_2002
COD : xác định theo Vi_TCVN6491:1999
Nito tổng : xác định theo TCVN 2620:2014 Photpho tổng : xác định theo TCVN 8940:2011
2.5. Nghiên cứu quá trình sản xuất hydro sinh học của chủng Clostridium sp.
Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của một số nguồn cơ chất lên sự phát triển và sinh hydro của chủng Clostridium sp. Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Sau khi lựa chọn được một số nguồn cơ chất phù hợp tiến hành lên men kết hợp 2 chủng và 3 chủng với nhau trên nguồn cơ chất phù hợp. Tiến hành tối ưu hóa sản lượng hydro với mơ hình lên men thích hợp nhất.
2.5.1. So sánh sản lượng hydro của các chủng Clostridium sp. phân lập được với một số chủng Clostridium khác một số chủng Clostridium khác
So sánh kết quả sản lượng hydro thu được với những kết quả nghiên cứu đã được công bố trên thế giới với mục đích xác minh ý nghĩa khoa học của các chủng
Clostridium sp. phân lập được.
2.5.2. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn cơ chất đến khả năng sinh trưởng và sinh khí của vi sinh vật của vi sinh vật
Nghiên cứu khả năng sinh trưởng và sinh khí của vi sinh vật trên 6 nguồn cơ chất khác nhau là glucose, sucrose, lactose, xylose và molasses (rỉ đường).
Thí nghiệm được thực hiện ở điều kiện nhiệt độ 37°C, thời gian 48h, tốc độ lắc 200rpm. Tiến hành thí nghiệm lên men đơn chủng, lên men kết hợp 2 chủng, lên men kết hợp 3 chủng. Tiến hành đo OD ở bước sóng 600nm.
2.6. Tối ƣu hóa các điều kiện lên men để nâng cao sản lƣợng hydro bằng phƣơng pháp đáp ứng bề mặt pháp đáp ứng bề mặt
Sau khi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nguồn cơ chất đến khả năng sinh trưởng và sinh khí của vi sinh vật, mơ hình lên men và nguồn cơ chất cho ra sản lượng hydro cao nhất sẽ được chọn lựa để tiến hành tối ưu.
Tiến hành tối ưu các thông số sử dụng phương pháp quy hoạch thực nghiệm Box–Behnken design và phần mềm DX7.1.5 để tối ưu hóa sản lượng hydro sinh ra [61]
2.7. Khảo sát khả năng sinh khí hydro của các chủng Clostridium sp. trên một số
nguồn cơ chất thuộc thế hệ thứ 2
2.7.1. Nguồn cơ chất là bột bã sắn
Để xác định khả năng sinh khí biohydrogen của vi sinh vật, các chủng nuôi cấy được nuôi trong môi trường bỗng rượu với tỷ lệ 20% dịch huyền phù vi sinh vật ở nhiệt độ 37°C trong 48h. Thí nghiệm được thực hiện với đơn chủng, nuôi kết hợp 2 chủng và kết hợp 3 chủng Clostridium, mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
2.7.2. Nguồn cơ chất là bỗng rượu
Để xác định khả năng sinh khí biohydrogen của vi sinh vật, các chủng nuôi cấy được nuôi trong môi trường bỗng rượu với tỷ lệ 20% dịch huyền phù vi sinh vật ở nhiệt độ 37°C trong 48h. Thí nghiệm được thực hiện với đơn chủng, ni kết hợp 2 chủng và kết hợp 3 chủng Clostridium, mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
2.8. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm Excel, kết quả nghiên cứu là giá trị trung bình giữa 3 lần thí nghiệm và sai số được tính tốn.
CHƢƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả phân lập và định danh các chủng Clostridium sp. phân lập đƣợc từ dạ dày bò dày bò
Lên men sản xuất hydro có thể được tiến hành với hỗn hợp các chủng vi sinh vật hoặc đơn chủng. Tuy nhiên, trong hệ vi sinh vật đa dạng của dạ cỏ bị khơng chỉ chứa các vi sinh vật sinh hydro mà còn bao gồm cả những vi sinh vật tiêu thụ hydro và những vi sinh vật lên men sinh ra các axit béo dễ bay hơi khác như axit acetic, axit butyric,.... điều này khiến cho việc thu hồi và làm sạch khí hydro gặp nhiều khó khăn, đồng thời cũng gây khó khăn trong q trình nghiên cứu để tối ưu hóa sản lượng hydro sinh ra. Do đó, việc tiến hành chọn lọc các chủng vi sinh vật sinh hydro là cần thiết để tối ưu hóa sản lượng hydro thu được.
Tiến hành lên men vi sinh vật ở 37°C trong 48h đối với những khuẩn lạc có hình dạng khác nhau, sau đó quan sát bình serum để xác định khả năng sinh khí biogas:
Phần đáy bình có những bọt khí nhỏ chứng tỏ có khí sinh ra.
- Quan sát nắp cao su thấy nắp cao su cứng và phồng lên chứng tỏ có khí sinh ra.
- Môi trường nuôi cấy đục màu và sau khi để lắng khoảng 30 phút thấy đáy bình có cặn màu trắng chứng tỏ đã có sự phát triển của vi sinh vật một cách mạnh mẽ.
- Dựa vào kết quả đo lượng khí hydro bằng máy GC xác định % khí hydro sinh ra của chủng sinh khí.
Kết quả: có 8 chủng vi sinh vật sinh hydro trong lần làm giàu thứ 3, ký hiệu là
ST1, ST2, ST3, ST4, ST5, ST6, ST7, ST8. Trong đó, chủng vi sinh vật ST1, ST2, ST3, ST4 phân lập được từ môi trường PY, chủng ST5 và ST6 phân lập được trong môi trường PYG, chủng ST7 và ST8 phân lập được trong cả 2 môi trường PY và PYG (Bảng3.1).
Bảng 3.1: Sản lƣợng khí hydro trong các mẫu làm giàu lần 3
Mẫu phân lập Lƣợng khí hydro tạo thành (mL/L) ST1 459,25 ± 5,31 ST2 0 ST3 47,65 ± 6,03 ST4 568,05 ± 8,27 ST5 439,19 ± 8,42