2.2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
2.2.1. Mục tiêu của luận văn
Nghiên cứu thành phần hóa học và khảo sát hoạt tính sinh học lồi san hơ mềm Sinularia erecta.
2.2.2. Các nội dung nghiên cứu
- Phân lập một số hợp chất hóa học từ san hơ mềm Sinularia erecta. - Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất bằng các phương pháp hóa lý.
- Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào các hợp chất phân lập được.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp xử lý mẫu, tạo dịch chiết, phân lập các hợp chất
2.3.1.1 Phương pháp xử lý mẫu
Việc xử lý các mẫu sinh vật biển được thực hiện theo quy trình thống nhất đã được xây dựng qua các nhiệm vụ khoa học của Viện Hóa sinh biển:
Bước 1: Mẫu san hô mềm sau khi lấy ra khỏi tủ lạnh âm sâu được tiến hành
rã đông bằng cách để trên bệ rửa thí nghiệm, cho nước sạch chảy đều trên bề mặt của mẫu nghiên cứu, các lớp đá bao quanh mẫu san hô mềm được tan từ từ để lộ phần thân của mẫu san hô mềm. Mẫu được ngâm trong nước lạnh trong thời gian từ 2-3 giờ nhằm loại bỏ từ từ hàm lượng muối vô cơ.
Bước 2: Sau khi mẫu san hô mềm đã được rã đông, loại bỏ các phần túi
nylon và các thành phần vi sinh vật biển khác bám trên bề mặt của mẫu san hô mềm. Lưu lại tiêu bản mẫu, để mẫu sinh vật biển lên mặt bàn thí nghiệm và chụp ảnh để lưu phần mẫu trước khi xử lý.
Bước 3: Sau khi mẫu san hô mềm đã được loại bỏ các thành phần nylon và
các thành phần khác, mẫu được để trên túi lưới ở nhiệt độ phịng cho đến khi khơ hết bề mặt của phần thân mẫu san hô mềm. Mẫu được cân để thu được khối lượng thực tế trước khi tiến hành xử lý.
Bước 4: Mẫu được cắt nhỏ thành từng phiến, chiều rộng và dài của phiến tùy
theo độ cứng của mẫu san hơ mềm. Các phiến càng mỏng thì khả năng làm khơ mẫu và xay mẫu càng thuận lợi.
Bước 5: Sấy và làm khô các mẫu san hô mềm. Các mẫu san hô mềm sau khi
đã được cắt thành các phiến nhỏ được chuyển vào túi lưới và tiến hành làm khô sơ bộ bằng phương pháp sấy khô trên thiết bị tủ sấy chân không hoặc phơi dưới điều kiện ánh sáng mặt trời (có tránh tia tử ngoại). Trong quá trình sấy mẫu này, khối lượng mẫu san hô mềm giảm xuống rất nhanh.
Bước 6: Làm khô mẫu trên thiết bị đông khô.
2.3.1.2. Phương pháp nghiên cứu tạo dịch chiết phân đoạn
Bước 1: Chuẩn bị mẫu thử: Các mẫu san hô mềm được lấy lượng 5 mg mẫu
khơ, cho vào bình định mức 10 ml.
Bước 2: Đánh số thứ tự và ký hiệu các bình chiết mẫu. Thêm dung mơi theo
thứ tự tăng dần độ phân cực, dung môi được thêm đến vạch định mức.
Bước 3: Toàn bộ các bình chiết được cho lên máy lắc ngang, lắc đều cho
dung môi thấm đều trên bột san hô mềm. Để lắng trong khoảng 1-2 giờ.
Bước 4: Lọc mẫu, phần dịch lọc được cất loại dung môi trên thiết bị cất
quay, dịch thô thu được cho vào lọ nhỏ phục vụ cho việc kiểm tra lượng vết chất và khả năng hòa tan mẫu nghiên cứu.
Bước 5: Sử dụng sắc ký bản mỏng TLC và hệ dung môi CH2Cl2 : MeOH với tỷ lệ thích hợp để đánh giá các mẫu thô thu được.
2.3.1.3. Phương pháp phân lập chất
- Sắc ký lớp mỏng: Sắc ký lớp mỏng là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã đặt hỗn hợp các chất cần tách. Pha tĩnh là chất hấp phụ được chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân tích. Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ lệ quy định trong từng chuyên luận. Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử được di chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha động, với những tốc độ khác nhau. Kết quả, ta thu được một sắc ký đồ trên lớp mỏng.
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khơ rồi hơ nóng trên bếp điện từ đến khi hiện màu.
- Sắc ký cột: Nguyên lí tách của sắc kí cột cũng như của các loại sắc ký khác: một
mẫu thử được nạp lên một cột chứa chất hấp phụ (thường là silica gel, nhôm oxide).Cột chứa chất hấp phụ này đóng vai trị là một pha tĩnh. Một dung môi khai triển (pha động) di chuyển dọc theo cột sẽ làm di chuyển các cấu tử của mẫu thử, do các cấu tử này có độ phân cực khác nhau nên ái lực của chúng với pha tĩnh cũng
khác nhau. Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel pha thường và pha đảo. Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240-430 mesh). Silica gel pha đảo ODS hoặc YMC (30-50 μm, FuJisilisa Chemical Ltd.).
- Hệ thống sắc ký lỏng trung áp (MPLC): Hệ thống bao gồm Detector UV-vis bước
sóng từ 200-900 nm, bộ lấy mẫu tự động (fraction collector) kèm theo với các dãy ống nghiệm kích thước thay đổi tùy theo lượng mẫu, hệ thống bơm với khả năng điều chỉnh áp từ 1 đến 10 bar, tốc độ dòng từ 1ml/phút đến 200 ml/phút. Cột tách SNAP loại C8, C18 với dung lượng từ 100g đến 450g mẫu đầu vào.
- Hệ thống lấy mẫu tự động (Fraction collector): Mẫu được đưa qua cột sắc ký bằng
thủy tinh với pha tĩnh là silica gel pha thường hoặc pha đảo. Cơ chế phân tách dựa trên sự tương tác giữa chất và pha tĩnh, dung môi với tỷ lệ phù hợp. Mẫu được thu thập thông qua máy lấy mẫu tự động.
Các thiết bị sử dụng nêu trên thuộc Viện Hoá sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.3.2. Xác định cấu trúc các hợp chất sử dụng phổ cộng hưởng từ hạt nhân
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR - Nuclear Magnetic Resonance) là một phương pháp vật lý hiện đại nghiên cứu cấu tạo của các hợp chất hữu cơ, nó có ý nghĩa quan trọng để xác định cấu tạo các phân tử phức tạp như các hợp chất thiên nhiên.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân, một chiều và hai chiều được đo trên máy Bruker Avance AM500 FT-NMR Spectrometer, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam.
Chất nội chuẩn được sử dụng là TMS (tetramethyl silane). Các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân sử dụng:
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều: 1H-NMR, 13C-NMR.
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều: 1H-1H COSY, ROESY, HSQC, HMBC.
2.3.3. Phương pháp nghiên cứu thử nghiệm hoạt tính diệt tế bào ung thư
Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute – NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro.
Phương pháp MTT được sử dụng để nghiên cứu thử nghiệm hoạt tính diệt tế bào ung thư. Nguyên tắc của phương pháp này là đánh giá hoạt động trao đổi chất của tế bào sống thông qua hoạt động của enzyme oxidoreductase phụ thuộc NADPH. Enzyme này sẽ khử thuốc nhuộm 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)- 2,5 diphenyltetrazolium bromide (MTT) thành sản phẩm formazan có màu tím và khơng tan. Giá trị mật độ quang học (OD – Optical Density) đo được của formazan sau khi hịa tan trong dung mơi thích hợp sẽ phản ánh mức độ hoạt động của enzyme, tương ứng với độ sống của tế bào [7][ 22]. Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau:
- Tế bào được nuôi trong đĩa 96 giếng với mật độ 2.0 x 104 tế bào/ml, ủ ở nhiệt độ 37oC, 5% CO2 trong 24 giờ.
- Tế bào được xử lý với các hợp chất ở những nồng độ khác nhau (0.3, 1, 3, 10, 30, và 100 l trong DMSO), ủ ở nhiệt độ 37o
C, 5% CO2 trong 48 giờ.
- Sau đó, dung dịch MTT 0.5 mg/ml lần lượt được thêm vào và tiếp tục ủ ở nhiệt độ 37oC, 5% CO2 trong 4 giờ.
- Hàm lượng formazan tạo thành được đánh giá bằng phương pháp đo mật độ quang OD ở bước sóng 570 nm, sẽ phản ánh số lượng tế bào sống trong dịch nuôi cấy.
Khả năng sống sót của tế bào khi có mặt chất thử sẽ được xác định thông qua công thức sau:
% sống sót = [OD(chất thử) - OD(mơi trường trắng)] x 100% OD(đối chứng âm) - OD(môi trường trắng) % ức chế = 100% % sống sót
% ức chế ˃ 50% sẽ được chọn ra để thử nghiệm tiếp trên giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự phát triển).
- Các phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Etoposide và camptothecin được sử dụng như là chất đối chứng dương.
- DMSO 10% luôn được sử dụng như đối chứng âm. Giá trị IC50 sẽ được xác định nhờ vào phần mềm TableCurve. Trong khuôn khổ luận văn này, chất thử nào có IC50 < 100 μg/ml (với chất chiết thơ hoặc phân đoạn hóa học) hoặc IC50 100 M (với hoạt chất tinh khiết) sẽ được xem là có biểu hiện hoạt tính gây độc tế bào
và có khả năng ức chế sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư.
Phương pháp nghiên cứu thử nghiệm hoạt tính diệt tế bào ung thư được thử nghiệm tại phịng Hoạt chất sinh học, Viện Hố sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.3.4 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng viêm
Nguyên lý
Gốc tự do nitric oxide (•NO) được sản sinh ở nhiều loại tế bào khác nhau. Dạng •NO xuất tiết có mặt ở các tế bào như đại thực bào, nguyên bào sợi hay tế bào gan thường được sản sinh với lượng lớn khi xuất hiện các đáp ứng viêm [40].
Một phương pháp được sử dụng để xác định gián tiếp •NO là đo màu các thành phần sản phẩm của nó (nitrate và nitrite). Phản ứng này địi hỏi rằng nitrate (NO3) đầu tiên được giảm thành nitrite (NO2), do tác động của nitrate reductase.
NO3- Nitrate reductase NO2- Nitrate Nitrite
Nitrite được phát hiện và phân tích bằng cách hình thành một màu hồng đỏ khi mẫu thử có chứa NO2- với thuốc thử Griess.
Khi thêm axit sulphanilic, nitrite tạo thành muối diazonium, sau đó các thuốc nhuộm azo (N-alpha-naphthyl-ethylenediamine) được thêm vào để tạo thành màu hồng.
Phương pháp MTT (3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) là một phương pháp so màu, đo độ suy giảm màu để đánh giá khả năng sống sót của tế bào. Ở các tế bào sống, hệ enzyme oxidoreductase hoạt động mạnh, những enzyme này có khả năng phân giải MTT thành dạng formazan khơng hồ tan, màu tím đậm. Do vậy, tỉ lệ tế bào sống sót được suy ra từ lượng formazan tạo thành từ MTT. Lượng formazan tạo thành được hoà tan bởi dung môi hữu cơ (DMSO, propanol) và đo độ hấp thụ ở bước sóng 570 mm. Khả năng gây độc tế bào của các mẫu thử nghiệm được suy ra từ việc đánh giá khả năng sống sót của tế bào.
Các bước tiến hành:
Tế bào RAW264.7 được nuôi cấy 48 giờ trong môi trường DMEM ở 37oC, 5% CO2 với 10% FBS, penicillin và streptomycin sulphate. Sau đó chúng được ni cấy trong giếng phiến 96 với mật độ 2,5 x 105
tế bào/giếng. Tế bào được kích thích với LPS trong 24 giờ với sự có mặt của các hợp chất thử ở nhiều nồng độ khác nhau, được pha sẵn trong DMSO. Dịch nổi của tế bào phản ứng với thuốc thử Griess. NaNO2 ở các nồng độ khác nhau được sử dụng để xây dựng đường chuẩn. Độ hấp thụ được đo ở 570 nm. Cardamonin được sử dụng làm mẫu đối chứng [41].
Phần tế bào còn lại sau khi đã sử dụng để đánh giá các hoạt tính invitro được bổ sung dung dịch MTT (5mg/mL), ủ 4h ở 37o
C và 5% CO2. Sau đó hút bỏ hết mơi trường trên bề mặt, kết tủa formazan được hòa tan trong isopropanol. Độ hấp thụ được đo ở 570 nm
CHƢƠNG 3- THỰC NGHIỆM 3.1. Phân lập các hợp chất từ san hô mềm Sinularia erecta
3.1.1. Phân lập các hợp chất
Mẫu san hô mềm Sinularia erecta tươi (1,5 kg) sau khi được xử lý theo phương pháp xử lý mẫu sinh vật biển, được cắt thành từng miếng nhỏ và ngâm chiết MeOH sử dụng sóng siêu âm 3 lần (mỗi lần 2h) ở nhiệt độ phòng thu được cặn chiết MeOH tổng (150 g, M). Cặn MeOH được hịa vào nước (1.0 lít) và chiết phân lớp với n-hexane. Cô quay loại bỏ dung môi dưới áp suất giảm thu được cặn chiết n- hexane (48g, H) . Sau đó phần dịch nước được bổ sung dichloromethane tỉ lệ 1 : 1 thu được căn chiết dichloromethane (2g , D).
Hình 3.1. Sơ đồ chiết các phân đoạn từ mẫu Sinularia erecta
Cặn chiết H và D được tiến hành phân tách thô bằng hệ thống sắc ký lỏng trung áp với cột nhồi silica gel pha thường. Rửa giải gradient bằng hệ dung môi dichloromethane : methanol (từ 100:1 đến 1:1) thu được 9 phân đoạn (H1→H9). Phân đoạn H3 (2g) tiếp tục được phân tách bằng hệ thống sắc ký lỏng trung áp với
cột pha đảo YMC RP-18, sử dụng pha động là methanol: nước (2:1) thu được 2 phân đoạn ký hiệu H3A và H3B. Phân đoạn H3A (120 mg) được phân tách tiếp bằng sắc ký cột silica gel pha thường, rửa giải bằng hệ dung môi dichloromethane: acetone (20/1) kết hợp với sắc ký cột silica gel pha thường rửa giải bằng hệ dung môi n-hexane : etyl acetate 5/1 thu được hợp chất 4 (1,8 mg). Phân đoạn H3B (900 mg) được phân tách tiếp bằng sắc ký cột silica gel pha thường, rửa giải bằng hệ dung môi n-hexane : acetone (10/1) kết hợp với sắc ký cột silica gel pha thường rửa giải bằng hệ dung môi dichloromethane: etyl acetate 5/1 thu được hợp chất 5 (2,8 mg).
Hình 3.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ phân đoạn n-Hexan (H)
Phân đoạn H4 + H5 (10g) được phân tách bằng hệ thống sắc ký lỏng trung áp với cột pha đảo YMC RP-18, sử dụng pha động là methanol: H2O (1/1 →10/1) thu
được 7 phân đoạn ký hiệu H5A →H5G. Phân đoạn H5B (120 mg) được phân tách tiếp bằng sắc ký cột silica gel pha thường, rửa giải bằng hệ dung môi dichloromethane: acetone (10/1) kết hợp với sắc ký cột silica gel pha thường rửa giải bằng hệ dung môi n-hexane : acetone 7/1 thu được 3 hợp chất: 1 (1,5 mg), 2 (3mg), 3 (3,5mg). Phân đoạn H5C (190 mg) được phân tách tiếp bằng sắc ký cột silica gel pha thường, rửa giải bằng hệ dung môi dichloromethane: acetone (15/1) thu được 4 phân đoạn H5C1- H5C4. Phân đoạn H5C3(16mg) được phân tách trên sắc ký cột silica gel pha thường rửa giải bằng hệ dung môi n-hexane : acetone 5/1 thu được hợp chất 6 (5 mg). Phân đoạn H5E (55mg ) được phân tách tiếp bằng sắc ký cột silica gel pha thường, rửa giải bằng hệ dung môi dichloromethane: acetone (10/1) kết hợp với sắc ký cột silica gel pha thường rửa giải bằng hệ dung môi n- hexane: acetone 5/1 thu được hợp chất 7 (1,6 mg) và hợp chất 8 (4,7mg).
3.1.2. Hằng số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập được
- Hợp chất 1: 3β,5α-dihydroxyeudesma-4(15),11-diene (chất mới)
Chất không màu, dạng dầu; [α]D + 10 ( c = 0,05; CHCl3); Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS m/z 237,18549 [M + H]+ , M =236. Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) và 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) được trình bày trên bảng 4.1.
- Hợp chất 2: 4(15)-Eudesmene-1β, 6α-diol
Chất không màu, dạng dầu; [α]D + 10 ( c = 0,05; CHCl3); Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) và 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) được trình bày trên bảng 4.2. - Hợp chất 3: 6α-Hydroxy-eudesm-4(15)-ene-1-one
Chất không màu, dạng dầu; [α]D + 40 ( c = 0,05; CHCl3); Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) và 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) được trình bày trên bảng 4.3. - Hợp chất 4: 4β,15-epoxyeudesmane-1β, 6α-diol
Chất không màu, dạng dầu; [α]D - 25 ( c = 0,05, CHCl3); Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) và 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) được trình bày trên bảng 4.4.
- Hợp chất 5 : Aromadendrane-4β, 10α-diol
Chất bột màu trắng; [α]D - 23 ( c = 0,05; CHCl3); Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) và 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) được trình bày trên bảng 4.5
- Hợp chất 6 : Aromadendrane-4α, 10α-diol
Chất bột màu trắng; [α]D - 42 ( c = 0,05; CHCl3); Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) và 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) được trình bày trên bảng 4.6.