Hình 4.1.7c. Phổ HSQC của hợp chất 7
Các tương tác 1
H-13C thu được từ việc phân tích phổ HSQC (hình 4.1.7c) của hợp chất 7 bao gồm các tín hiệu cộng hưởng của proton H 1,10 (H3-14) với C
với C 24,88 (C-11), giữa H 1,21 (H3-12) với C 30,59 (C-15), cho thấy sự hiện diện của 04 nhóm methyl singlet, khơng có sự trùng lấp của hai nhóm geminal methyl như đối với trường hợp hợp chất 5.
Tiếp tục phân tích tiếp các tương tác 1H-13C thu được từ việc phân tích phổ HSQC (hình 4.1.7c) của hợp chất 7, các số liệu thu được trình bày trong bảng 4.7
Bảng 4.7. Số liệu phổ NMR của hợp chất 7 C aC Cb,c Hb,d dạng pic (J = Hz) HMBC (1H 13 C) 1 56,4 55,85 1,74 m 2 24,3 24,15 1,58 m/1,64 m 3 41,4 41,22 1,53 m/1,68 m 4 80,3 80,34 - 5 47,2 47,38 1,72 m 6 30,1 29,48 0,38 dd (10,0; 10,5) 7 26,9 26,89 0,58 m 8 19,2 19,18 1,37 m/1,65 m 9 42,8 42,74 1,52 m/1,68 m 10 71,8 71,83 - 11 25,1 24,88 1,25 s 3, 4, 5 12 30,5 30,59 1,21 s 1, 9, 10 13 20,9 20,92 - 14 16,4 16,51 1,10 s 6, 7, 13, 15 15 28,7 28,73 1,03 s 6, 7, 13, 14
aCcủa hợp chất aromadendrane-4,10-diol [6], bĐo trong CDCl3, c
125 MHz, d500 MHz.
Phân tích phổ HMBC (hình 4.1.7d) của hợp chất 7 cho các tương tác HMBC giữa proton H3-12 (H 1,21) với C-1 (C 55,85), C-9 (C 42,74), C-10 (C 71,83); Tương tác giữa proton H3-11 (H 1,25) với C-3 (C 41,22), C-4 (C 80,34), C-5 (C 47,38); Tương tác giữa proton H3-14 (H 1,10) với C-13 (C 20,92), C-6 (C 29,48), C-7 (C 26,89). Các phân tích HMBC nêu trên và các phân tích HMBC chi tiết tại bảng 4.1.7d cho thấy hợp chất 7 có các nhóm hydroxyl tại C-4, C-10, vịng
cyclopropane và 02 nhóm methine tại vị trí C-1 và C-5 tương tự như hợp chất 5, 6. So sánh các số liệu về độ chuyển dịch hóa học của các hợp chất 5, 6 và 7 cho thấy các hợp chất này cùng có bộ khung và cấu trúc phẳng. Sự khác nhau chủ yếu của hợp chất 7 so với hợp chất 5 và hợp chất 6 ở vị trí C-10 và độ chuyển dịch hóa học của proton tại H-1 và H2-9. Cụ thể, độ chuyển dịch hóa học 13Cđối với hydroxyl của hợp chất 7 là C-10 (C 71,83) trong khi đó hydroxyl C-10 (C 75,49) đối với hợp chất 6 và hydroxyl C-10 (C 75,04) của hợp chất 5.
Hình 4.1.7d. Phổ HMBC của hợp chất 7
Đối với trường hợp hợp chất 6 cả 02 nhóm alcohol bậc 3 liên kết với hydroxyl C-4, C-10 ở cùng phía với H-1, độ chuyển dịch hóa học của proton tại H-1 (H 2,16) đối với hợp chất 6. Trường hợp hợp chất 5 duy nhất nhóm alcohol bậc 3 liên kết với hydroxyl C-10 cùng phía với H-1, độ chuyển dịch hóa học của proton tại H-1 (H 1,87) đối với hợp chất 5. Trong trường hợp của hợp chất 7, độ chuyển dịch hóa học của proton tại H-1 (H 1,74) và sự thay đổi độ chuyển dịch hóa học của proton tại H2-9 so với cùng vị trí trên hợp chất 5 và 6. Với sự thay đổi so với cùng
vị trí tại các hợp chất nêu trên, có thể nhận thấy proton H-1 ở khác phía hồn tồn so với các nhóm alcohol bậc 3 trên các hydroxyl ở hợp chất 7. Trong khi đó kết quả so sánh độ chuyển dịch hóa họccủa hợp chất 7 ở các vị trí tương ứng với giá trị độ chuyển dịch hóa học của hợp chất aromadendrane-4,10-diol [6] ở các vị trí tương ứng, kết quả cho thấy sự phù hợp. Vậy hợp chất 7 được xác định là aromadendrane- 4, 10-diol (hình 4.1.7e).
Hình 4.1.7e. Các tương tác HMBC chính và cấu trúc hóa học của hợp chất 7
IV.1.8. Hợp chất 8: Alloaromadendrane-4,10-diol
Hợp chất 8 được phân lập dưới dạng bột, không màu. Tương tự như hợp chất
5, 6, 7, trên phổ 1H (hình 4.1.8a) và 13C-NMR (hình 4.1.8b) của hợp chất 8 cho thấy các tín hiệu của 02 carbon khơng liên kết trực tiếp với hydron, có liên kết trực tiếp
với oxy, 01 carbon bậc 4 tại C 18,78 (C-13) có độ chuyển dịch hóa học về phía trường cao hơn so với những carbon bậc 4 thông thường cho thấy khả năng carbon bậc 4 này thuộc vịng cyclopropan, 04 nhóm methylene, 04 nhóm methine, 04 nhóm methyl singlet.
Phân tích độ chuyển dịch hóa học của proton H-6 với H 0,01 (1H, dd, j= 9,5; 9,0 Hz) và proton H-7 với H 0,62 (1H, m) cho thấy hai proton này không thể ở dạng trans, với hằng số tương tác tại H-6 tương ứng là 9,5; 9,0 Hz có thể suy luận proton H-6 và H-7 ở dạng cis để hình thành lên cis-cyclopropane tương tự như đối với trường hợp của hợp chất 5. Nhận định này được chứng minh khi so sánh độ
chuyển dịch hóa học của 13Cđối với hai methyl carbon ở dạng geminal đính trực tiếp vào 01 carbon bậc 4 thuộc vòng cyclopropane, các giá trị C 16,25 (C-14) và C 28,59 (C-15) của hai nhóm carbon methyl này hồn toàn phù hợp với các giá trị
tương ứng của carbon trên cis-cyclopropane [6], đồng thời khác so với các giá trị tương ứng của trans-cyclopropan [21]
Hình 4.1.8a. Phổ 1H-NMR của hợp chất 8
Hình 4.1.8c. Phổ HSQC của hợp chất 8
Tiếp tục phân tích tiếp các tương tác 1H-13C thu được từ việc phân tích phổ HSQC (hình 4.1.8c) của hợp chất 8, các số liệu thu được trình bày trong bảng 4.8.
Bảng 4.8. Số liệu phổ NMR của hợp chất 8 C aC Cb,c Hb,d dạng pic (J = Hz) HMBC (1H 13 C) 1 54,0 54,06 2,49 m 2 25,1 25,19 1,61 m/1,72 m 3 37,4 37,50 1,65 m/1,85 m 4 82,1 82,15 - 5 47,8 47,81 1,74 m 6 25,3 25,37 0,01 dd (9,0; 9,5) 7 28,8 28,83 0,62 m 8 18,7 18,68 1,42 m/1,64 m 9 37,9 38,02 1,60 m/1,69 m 10 74,3 74,34 - 11 25,6 25,65 1,34 s 3, 4, 5 12 32,2 32,18 1,20 s 1, 9, 10 13 18,6 18,78 - 14 16,4 16,25 1,04 s 6, 7, 13, 15 15 28,5 28,59 1,03 s 6, 7, 13, 14 aCcủa hợp chất alloaromadendrane-4,10-diol[12], b Đo trong CDCl3, c 125 MHz, d500 MHz
Hình 4.1.8d. Phổ HMBC của hợp chất 8
Phân tích phổ HMBC (hình 4.1.8d) của hợp chất 8 cho các tương tác HMBC giữa proton H3-12 (H 1,20) với C-1 (C 54,06), C-9 (C 38,02), C-10 (C 74,34); Tương tác giữa proton H3-11 (H 1,34) với C-3 (C 37,50), C-4 (C 82,15), C-5 (C 47,81); Tương tác giữa proton H3-14 (H 1,04) với C-13 (C 18,78), C-6 (C 25,37), C-7 (C 28,83). Các phân tích HMBC nêu trên, các phân tích HMBC chi tiết tại bảng 4.8 cho thấy hợp chất 8 có các nhóm hydroxyl tại C-4, C-10, vòng cyclopropan và 02 nhóm methine tại vị trí C-1 và C-5 tương tự như hợp chất 5, 6, 7. Từ các phân tích nêu trên có thể nhận thấy hợp chất 8 được hình thành giữa sự kết nối của vòng cis-cyclopropane, vòng cycloheptane và vòng cyclopentane tại các vị trí C-1, C-5, C-6 và C-7. Sự kết nối giữa vòng cycloheptanevà vòng cyclopentane tại vị trí C-1 và C-5 có thể ở hai dạng cis và trans. Trong đó dạng cis hình thành lên dạng allo-aromadendrane và dạng trans hình thành aromadendrane.
Tiếp tục phân tích độ chuyển dịch hóa học của proton H-6 với H 0,01 (1H, dd, j=
9,5; 9,0 Hz) và proton H-5 với H 1,74 (1H, m), với hằng số tương tác của proton H- 6 và H-5 cho thấy hai proton có góc lệch >900, và hai proton này ở hai vị trí đối
ngược nhau (Trong trường hợp hai proton này cùng phía, góc lệch trong khoảng 600 sẽ khơng hình thành được hằng số tương tác lớn trên proton H-6 theo tính tốn lý thuyết của phương trình Karplus) [12].
Tính tốn được hằng số tương tác giữa proton H-5 và H-1 sẽ xác định được kiểu cis hoặc trans của hai proton này và kết hợp với phổ NOESY. Tuy nhiên, hai proton này bị overlap và do đó khơng thể tính tốn được hằng số tương tác, do lượng chất ít khơng đủ đo phổ NOESY. Cho nên, tiến hành việc so sánh số liệu độ chuyển dịch hóa học của hợp chất 8 với các số liệu tương ứng của hợp chất 5, 6 và 7 cho thấy sự khác biệt, nhất là nhóm hydroxyl C-4 với giá trị lần lượt là C 82,15 đối với hợp chất 8, C 80,34 đối với hợp chất 7, C 80,23 đối với hợp chất 6 và C 80,39 đối với hợp chất 5. Rõ ràng sự khác biệt này không phải do ảnh hưởng của cấu hình của nhóm alcohol bậc 3 liên kết với hydroxyl C-4 hoặc nhóm methyl bậc 3 liên kết với hydroxyl C-4, sự thay đổi dạng /-OH ở vị trí này khơng làm thay đổi độ chuyển dịch hóa học của hydroxyl C-4 trên các hợp chất 5, 6 và 7. Như vậy, sự khác biệt này cho phép nhận định khung của hợp chất 8 không ở dạng aromadendrane như đối với hợp chất 5, 6, 7.. Tuy nhiên, với sự xuất hiện của các nhóm thế và độ chuyển dịch hóa học có thể nhận định hợp chất 8 sẽ kết nối vòng cyclopentan và cyclohexane ở vị trí C-1, C-5 theo kiểu cis [12], kết nối giữa vịng cycloheptane và vịng cyclopentane tại vị trí C-1 và C-5 ở dạng này sẽ hình thành dạng khung alloaromadendrane [12]. So sánh độ chuyển dịch hóa học 13
C của hợp chất 8 ở các vị trí tương ứng là với giá trị độ chuyển dịch hóa học 13C của hợp chất alloaromadendrane-4, 10-diol [12] [15] ở các vị trí tương ứng, kết quả cho thấy hợp chất 8 chính là alloaromadendrane-4,10-diol (hình 4.1.8e)
Cấu trúc các hợp chất phân lập đƣợc từ san hô mềm Sinuralia erecta 3, 5-dihydroxyeudesma-4(15),11-diene (1) (Chất mới) 4(15)-Eudesmene-1β,6α-diol (2) 6-hydroxy-eudesm-4(15)-ene-1-one (3) 4β,15-epoxyeudesmene-1,6α-diol (4) aromadendrane-4,10-diol ( 5 ) aromadendrane-4,10-diol ( 6 ) aromadendrane-4,10-diol ( 7 ) alloaromadendrane-4,10-diol ( 8 )
4.2. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ các hợp chất phân lập đƣợc
4.2.1. Kết quả thử sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào
Các hợp chất phân lập được tiến hành lựa chọn để nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào, mẫu cặn chiết n-hexane và các chất sạch 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 , 8 được thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào trên 3 dòng tế bào ung thư: ung thư phổi người A549, ung thư cổ tử cung người Hela và ung thư tuyến tụy người PANC-1.
Bảng 4.9. Kết quả thử sàng lọc độc tế bào của các mẫu
Mẫu N.độ TB sống sót (CS%)
Hela A549 PANC-1
% TB sống Sai số % TB sống Sai số % TB sống Sai số Control 100,00 0,94 100,00 0,11 100,00 0,57 Cặn chiết n- hexane 30 µg/mL 63,48 2,55 52,03 2,96 57,17 0,84 100 µg/mL 12,91 3,66 6,77 1,19 6,68 0,90 Hợp chất 1 30 µM 72,56 2,53 33,98 1,07 66,76 1,58 100 µM 60,85 3,60 22,44 2,94 53,75 1,64 Hợp chất 2 30 µM 74,13 1,29 70,68 1,61 71,98 1,97 100 µM 67,03 2,88 53,75 3,40 69,56 2,46 Hợp chất 3 30 µM 60,82 2,46 62,19 1,34 56,42 1,68 100 µM 51,79 2,73 62,04 3,98 53,46 1,53 Hợp chất 4 30 µM 83,41 2,73 72,52 0,78 73,78 2,60 100 µM 75,87 2,10 50,84 2,86 72,30 1,68 Hợp chất 5 30 µM 83,03 2,53 63,84 1,92 74,73 3,85 100 µM 78,09 1,15 69,92 3,28 62,83 1,13 Hợp chất 6 30 µM 82,57 1,69 72,02 2,37 64,17 0,15 100 µM 75,03 0,82 62,96 3,56 55,30 2,66 Hợp chất 7 30 µM 82,92 3,18 66,90 1,61 62,59 1,38 100 µM 71,37 1,62 60,28 2,19 55,09 0,90
Hợp chất 8 30 µM 80,21 2,18 68,88 4,71 62,03 1,42 100 µM 65,43 1,87 55,43 1,20 55,30 1,01 Camptothecin* 0.1 µM 68,74 0,75 62,14 0,66 39,40 0,58 10 µM 26,41 0,31 35,38 0,13 9,23 0,48
*Camptothecin: được sử dụng làm chất chuẩn
Từ những phân tích trên bảng 4.9 cho thấy mẫu cặn chiết n-hexane thể hiện hoạt tính diệt tế bào mạnh (% tế bào sống sót <15%) ở nồng độ thử nghiệm 100 µg/mL trên cả 3 dịng tế bào ung thư phổi người A549, ung thư cổ tử cung người Hela và ung thư tuyến tụy người PANC-1. Ở dòng tế bào ung thư phổi người A549, hợp chất 1 thể hiện hoạt tính diệt tế bào mạnh ở cả hai nồng độ thử nghiệm 30 µM và 100 µM. Do đó, hợp chất 1 tiếp tục được đánh giá IC50.
Tìm giá trị IC50: Nồng độ ức chế 50%, IC50 được xây dựng trên 5 nồng độ thử nghiệm. Giá trị IC50 được xác định theo phương pháp hồi quy tuyến tính trên phần mềm Graphpad Prism 5.0
Kết quả nghiên cứu cho thấy giá trị IC50 (µM) của mẫu 1 trên dịng tế bào A549 là 14,79 ± 0,91, so với chất chuẩn được sử dụng Camptothecin 11,42 ± 0,13
4.2.2. Kết quả thử hoạt tính ức chế sự sản sinh nitric oxide
Mẫu cặn chiết n-hexane và các chất 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 được thử nghiệm
hoạt tính ức chế sự sản sinh nitric oxide (NO) trên tế bào RAW264.7
Bảng 4.10. Kết quả thử sàng lọc hoạt tính ức chế sản sinh NO của các mẫu
Tên mẫu N.độ % ức chế Sai số % tế bào sống Sai số
Control 100,00 0,50 118,17 3,16 LPS 0,00 1,00 100,00 2,04 Cặn chiết n- hexane 30 µg/mL 19,05 1,50 117,87 2,50 100 µg/mL 65,08 0,76 104,82 0,81 Hợp chất 1 30 µM 26,59 1,89 110,96 0,49 100 µM 35,32 0,76 107,83 2,61 Hợp chất 2 30 µM 15,48 2,78 106,93 2,07 100 µM 19,05 2,78 105,40 2,42 Hợp chất 3 30 µM 10,51 0,58 107,49 1,10
100 µM 15,32 1,89 105,39 0,76 Hợp chất 4 30 µM 10,51 2,84 76,22 1,81 100 µM 15,32 2,02 74,04 0,91 Hợp chất 5 30 µM 2,78 1,26 113,77 2,52 100 µM 9,52 0,50 108,93 1,11 Hợp chất 6 30 µM 1,59 2,75 109,41 0,49 100 µM 8,33 2,29 107,38 0,93 Hợp chất 7 30 µM 11,11 1,26 85,91 3,56 100 µM 22,62 1,00 81,80 2,90 Hợp chất 8 30 µM 26,19 1,80 101,21 1,47 100 µM 27,78 1,89 98,53 3,21 Cardamonin* 0,3 µM 26,98 1,61 104,17 1,63 3 µM 74,60 0,58 98,60 1,15
*Cardamonin: được sử dụng làm chất chuẩn
Kết quả thử nghiệm cho thấy: trong 13 mẫu, cặn chiết n-hexane có khả năng ức chế sự sản sinh NO ở nồng độ 100 µg/mL (65,08%). Khơng hợp chất nào có khả năng gây chết tế bào ở các nồng độ thử nghiệm.
KẾT LUẬN
1. Đã tiến hành thu thập mẫu san hô mềm Sinularia erecta Tixier-Durivault, 1945 ở khu vực đảo Cù Lao Chàm, Quảng Nam phục vụ nghiên cứu thành phần hóa học và khảo sát hoạt tính sinh học.
2. Từ lồi san hô mềm Sinularia erecta, bằng các phương pháp sắc ký kết
hợp với hệ dung mơi thích hợp đã chiết tách, phân lập được 08 hợp chất sesquiterpene trong đó có 1 chất mới. Cấu trúc hóa học của các hợp chất được xác định bằng cách kết hợp số liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều, hai chiều. Cụ thể như sau: + Hợp chất 1: 3β,5α-dihydroxyeudesma-4(15),11-diene (chất mới) + Hợp chất 2: 4(15)-Eudesmene-lβ,6-diol + Hợp chất 3: 6-Hydroxy-eudesm-4(15)-ene-1-one + Hợp chất 4: 4β,15-Epoxyeudesmene-1,6α-diol + Hợp chất 5: Aromadendrane-4,10-diol + Hợp chất 6: Aromadendrane-4,10-diol + Hợp chất 7: aromadendrane-4,10-diol + Hợp chất 8: alloaromadendrane-4,10-diol
3. Đã tiến hành nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào trên ba dòng tế bào ung thư thử nghiệm (ung thư phổi người A549, ung thư cổ tử cung người Hela và ung thư tuyến tụy người PANC-1) và ức chế sự sản sinh nitric oxide (NO). Kết quả cho thấy ở dòng tế bào ung thư phổi người A549, hợp chất 1 có hoạt tính diệt tế bào tốt với giá trị IC50 là 14.79 ± 0.91 µM. Kết quả thử nghiệm khả năng ức chế ức chế sự sản sinh NO các hợp chất không thu được kết quả tốt.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Phạm Quốc Long, Lưu Văn Huyền, Andrey B. Imbs, Tatiana N. Dautova (2008), Lipit và axit béo của rạn san hô Việt Nam , Đa dạng sinh học, NXB Khoa học và Kỹ thuật.
2. Châu Văn Minh, Phan Văn Kiệm, Nguyễn Hải Đăng (2007), Các hợp chất có hoạt tính sinh học từ sinh vật biển, NXB Khoa học và Kỹ thuật.
3. Võ Sĩ Tuấn, Nguyễn Văn Long, Phan Kim Hoàng, Hoàng Xuân Bền, Hứa Thái Tuyến, Nguyễn Xuân Hòa, Lyndon Devantier (2005), Đa dạng sinh học
khu bảo tồn biển Vịnh Nha Trang, Khánh Hòa, Việt Nam
Tiếng Anh
4. Ahmed A. F., Su J. H., Shiue R. T., Pan X. J., Dai C. F., Kuo Y. H., Sheu J.