1. Một số thơng tin về hóa chất bảo vệ thực vật
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.2. Phƣơng pháp xử lý mẫu và phân tích hóa chất BVTV
2.3.2.1. Lấy mẫu phân tích
Lấy mẫu để phân tích hóa chất BVTV từ đồng ruộng nghiên cứu tuân theo tiêu chuẩn Việt Nam 9016:2011- Rau tƣơi, Phƣơng pháp lấy mẫu trên ruộng sản xuất.
Mẫu đƣợc lấy lặp lại 2 lần tại bốn thời điểm (sau xử lý hóa chất BVTV) - Lần thứ nhất: 2 giờ sau khi xử lý
- Lần thứ hai: 72 giờ sau khi xử lý - Lần thứ ba: 168 giờ sau khi xử lý
- Lần thứ tƣ: 192 giờ sau khi xử lý (7 ngày sau thu hoạch)
2.3.2.2. Xử lý mẫu để phân tích xác định hóa chất BVTV
Mẫu sau khi lấy đƣợc bảo quản từ 10oC-15oC và vận chuyển về phịng thí nghiệm ngay trong ngày.
Mẫu đƣợc cắt, đồng nhất bằng thiết bị đồng nhất mẫu và chia thành 2 phần bằng nhau, một phần dùng để phân tích, phần cịn lại để lƣu mẫu đến khi có kết quả phân tích cuối cùng.
- Cân 10 g mẫu đã đƣợc cắt nhỏ và đồng nhất cho vào ống ly tâm loại 50 ml có nắp kín.
- Thêm 10 ml axetonitril (ACN) rung lắc mạnh khoảng 2 – 3 phút. Sau đó thêm 4 g MgSO4, 1 g NaCl, hỗn hợp muối xitrat 1g Na3C6H5O7 và 0,5 g Na2C6H6O7, đo pH mẫu đạt 5 -5,5. Rung lắc mạnh hỗn hợp khoảng 2-3 phút và ly tâm 3000vòng/phút trong 5 phút để pha hữu cơ đƣợc phân tách. Hút 4 ml pha hữu cơ và thêm các chất hấp phụ 30 mg PSA, 1 g MgSO4, lắc hỗn hợp khoảng 30 giây. Tiến hành ly tâm hỗn hợp, thu lấy pha hữu cơ, thêm 20 µl dung dịch 5% axit focmic vào 2 ml dịch chiết. Phân tích trên LC-MS/MS.
Hình 2: Quy trình chuẩn bị mẫu để xác định hóa chất VTV trên rau
Cơng thức tính dƣ lƣợng thuốc bảo vệ thực vật trong nơng sản
) )( ( ) )( )( ( 1 2 1 V m V V V a C Trong đó :
a dƣ lƣợng thuốc tính theo đƣờng chuẩn (µg/L) V thể tích acetonitrile thêm vào để chiết mẫu (ml) V1 thể tích dịch chiết cuối cho vào vial (ml) V2 thể tích axit focmic thêm vào vial (ml)
Mẫu (>1 kg) đƣợc cắt nhỏ ra, lấy khoảng 200 g mẫu đại diện và đồng nhất bằng thiết bị đồng nhất mẫu
Chuyển 10 g (m) mẫu đã đồng nhất vào ống ly tâm 50 ml
Thêm 10 ml (V) ACN +1 g Na3C6H5O7 .1,5 H2O + 1 g NaCl + 0,5g Na2C6H6O7. 2H2O +4 g MgSO4
Lắc mạnh trong khoảng 2-3 phút, sau đó ly tâm với tốc độ 3000 vòng /phút và trong 5 phút
Chuyển 4 ml vào ống ly tâm 15 ml trong đó đã có 1 g MgSO4+ 30 mg PSA và lắc trong khoảng 30 giây
Ly tâm 3000 vòng/phút trong khoảng 5 phút
Chuyển 2 ml(V1) dịch chiết vào vial 2 ml và thêm 20 µl(V2) dung dịch axít focmic 5% và lắc đều
2.3.3. Điều kiện phân tích
2.3.3.1. Điều kiện phân tích trên hệ thống HPLC
Cột phân tích: ZORBAX C18 (150 mm x 4,6 mm, 5 m) - Nhiệt độ buồng cột: 400C
- Tốc dòng: 0,6 ml/phút - Thể tích bơm mẫu: 20 l
Chƣơng trình dung mơi nhƣ sau: tỷ lệ kênh %A: %B = 65:35, trong thời gian 10 phút/mẫu.
2.3.3.2. Điều kiện phân tích hóa chất BVTVtrên LC-MS/MS
Chế độ ion hóa (ESI) áp dụng các thơng số nhƣ nêu ở bảng 2.3.
ảng 2.3: Các thông số của chế độ ESI
Nguồn ion hóa ESI/ positive/negativeMRM Nhiệt độ khí N2 300 oC
Lƣu lƣợng khí N2 8 lít/phút
Áp suất đầu phun 40 psi
Điện áp mao quản 4000 V
Chế độ quét MS/MS:MRM (SIM to SIM) với các thông số nhƣ nêu ở bảng 2.4
ảng 2.4: Các thông số chế độ quét MS/MS
Hoạt chất Thời gian lƣu (phút) Ion sơ cấp Ion thứ cấp Chu kỳ quét (ms) Điện áp phân mảnh (V) Năng lƣợng va chạm (V) Chlorothalonil 2,056 247,0 247,0 80 100 10 181,8 80 100 10 Diafenthiuron 5,635 385,2 329,2 100 80 15 238,2 100 80 28
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tối ƣu hóa các điều kiện xác định chlorothalonil và diafenthiuron 3.1.1. Điều kiện phân tích của sắc ký lỏng hiệu năng cao 3.1.1. Điều kiện phân tích của sắc ký lỏng hiệu năng cao
3.1.1.1. Lựa chọn cột phân tích
Cột tách là trái tim của hệ sắc ký, nó đóng góp một phần quan trọng trong việc quyết định quá trình tách. Các chất chlorothalonil và diafenthiuron là các chất kém phân cực, do đó cột tách đƣợc sử dụng là cột pha đảo. Hơn nữa, chất nhồi pha đảo sử dụng hệ dung mơi phân cực có tính kinh tế cao, phù hợp với điều kiện của phịng thí nghiệm. Trong nghiên cứu này, đƣợc lựa chọn cột tách và tiền cột pha đảo C18.
Thông số cột tách và tiền cột: Cột tách: Zorbax C18 (150 mm × 4,6 mm × 5 àm); Tin ct: Zorbax SB C18 (5 mm ì 4,6 mm ì 5 àm); Nhit bung ct: 400C
3.1.1.2. Lựa chọn tốc độ dịng và dung mơi pha động
Dung môi pha động sử dụng hỗ hợp nƣớc cất khử ion và ACN với 5 mmol amoni axetat.
+ Tốc độ dòng pha động
Đối với thiết bị LC-MS/MS và các thông số cột tách là Zorbax C18 (150 mm ì 4,6 mm ì 5 àm) thng sử dụng tốc độ dòng pha động từ 0,4-0,7 ml/phút.
Thực hiện phân tích hóa chất BVTV trên hệ thống sắc ký lỏng và khối phổ cùng điều kiện, chỉ thay đổi tốc độ dòng pha động thu đƣợc các píc cân đối đồng đều trong suốt q trình phân tích.
Bảng 3.1: Khảo sát tốc độ pha động phân tích các chất trên sắc ký lỏng khối phổ
STT Tốc độ dòng ml/phút Độ cân đối píc Diafenthiuron Độ cân đối píc Chlorothalonil 1 0,4 0,68 0,77 2 0,5 0,79 0,82 3 0,6 0,95 0,99 4 0,7 0,86 0,85 5 0,8 0,73 0,75
Dựa vào kết quả nhận đƣợc ở bảng 3.1 tốc độ dòng pha động 0,6 ml/phút là phù hợp để phân tích chlorothalonil và diafenthiuron, với tốc độ dịng này các píc của 2 chất nghiên cứu cân đối nhất.
+ Lựa chọn tỷ lệ pha động
Trong phƣơng pháp sắc kí lỏng khối phổ, pha động khơng chỉ ảnh hƣởng tới q trình tách các chất mà nó cịn ảnh hƣởng tới q trình ion hóa và tín hiệu của các chất phân tích. Với kỹ thuật ion hóa bằng dịng điện tử bắn phá các chất ở chế độ ion dƣơng, và ion âm, q trình ion hóa tăng khi có thêm các chất nhƣ axít axetic, axít focmic hoặc amoni axetat.
Hiện nay trên thế giới có xu hƣớng sử dụng hai chất để tăng thêm khả năng ion hóa là axít focmic và amoni axetat với nồng độ trong dung môi đều là 5 mmol. Với kinh nghiệm thực hiện phân tích nhiều loại hóa chất BVTV cho nhiều đối tƣợng nông sản chúng tôi sử dụng pha động hỗn hợp dung môi là nƣớc cất trao đổi ion và axetonitril. Để loại các píc nhiễu cơ chất của hai đối tƣợng nghiên cứu là rau cải và rau mùng tơi, chúng tơi sử dụng chƣơng trình gradient dung mơi nhƣ sau.
Bảng 3.2: Chương trình gradient dung mơi pha động
Thời gian (phút) Tốc độ dịng (ml/phút)
Kênh A (ACN:H2O 1:9) 5 mmol amoni axetat
Kênh B (ACN:H2O 9:1) 5 mmol amoni axetat
0 0,6 70 30 1 0,6 70 30 1,5 0,6 0 100 7 0,6 0 100 7,5 0,6 70 30 10 0,6 70 30
Thực hiện chạy cùng điều kiện trên thiết bị chỉ thay đổi chất làm tăng khả năng ion hóa chúng tơi thu đƣợc kết quả nhƣ trong bảng:
Bảng 3.3: Khảo sát chất làm tăng hả năng ion hóa mẫu
Chất làm tăng khả năng ion hóa
Tốc độ dịng ml/phút Độ đáp ứng diện tích Diafenthiuron Signal to Noise (S/N) Diafenthiuron Amoni axetat 0,6 9638 260,86 Focmic axít 5487 188,82
Hình 3.1: Sắc ý đồ khảo sát chất làm tăng hả năng ion hóa
Dựa vào bảng kết quả chúng tôi thấy chất ammoni axetat có tác dụng làm tăng khả năng ion hóa tốt hơn so với chất focmic axít.
3.1.2. Khảo sát điều kiện khối phổ MS/MS
Để phân tích hóa chất BVTV bằng sắc ký lỏng khối phổ MS/MS cần phải xác định đƣợc ion phân tử (ion mẹ) và ion sản phẩm (ion con) của hóa chất BVTV. Với nguồn ion hóa ESI, chế độ ion dƣơng và ion âm các ion phân tử thƣờng đƣợc tạo thành bằng cách thêm một proton vào khối lƣợng phân tử của chất đó hoặc bớt đi một proton. Dựa vào khối lƣợng phân tử của các hóa chất BVTV, trên cơ sở tham khảo các nghiên cứu trƣớc đây trên thế giới, chúng tôi đã xác định đƣợc các ion phân tử của từng hóa chất BVTV (bảng 2.4).
Tuy nhiên, để định tính và định lƣợng cần phải xác định đƣợc ion sản phẩm của từng hóa chất BVTV. Sử dụng kim tiêm mẫu 20 µl tiêm trực tiếp các chất chuẩn hóa chất BVTV có nồng độ 100 ng/ml vào MS để xác định hai ion con ứng với từng
hiệu thấp hơn đƣợc dùng cho mục đích xác nhận (khẳng định). Các thơng số bắn phá nhƣ Dwell time (Chu kỳ quét), Fragmentor (Điện áp phân mảnh), và CE (năng lƣợng va chạm) đƣợc tối ƣu tự động theo thiết bị MS. Các kết quả đƣợc tổng hợp ở bảng 2.4.
ảng 3.4: Điều iện tối ưu cho thiết bị HPLC – MS/MS
HPLC MS/MS
Tỷ lệ kênh A: B = 70%: 30%
Chế độ ion hóa: ESI-posetive-Diafenthiuron Chế độ ion hóa: ESI-negative-Chlorothalonil Tốc độ dịng: 0,6 ml/phút Chu kỳ quét: theo bảng 2.4
Áp suất đầu phun: 4000V Điện thế phân mảnh: theo bảng 2.4 Năng lƣợng va chạm: theo bảng 2.4
Các thơng số tối ƣu để phân tích chlorothalonil và diafenthiuron nhƣ sau: - Cột Zorbax C18 (150 mm ì 4,6 mm ì 5 àm)
- Tiền cột Zorbax SB C18 (5 mm ì 4,6 mm ì 5 àm) - Gradient pha động nhƣ bảng 3.2
- Tốc độ dòng: 0,6 ml/phút
- Điều kiện khối phổ nhƣ trong bảng 2.3
3.2. Đánh giá phƣơng pháp phân tích 3.2.1. Xây dựng đƣờng chuẩn 3.2.1. Xây dựng đƣờng chuẩn
Xây dựng đƣờng chuẩn là một trong những yêu cầu đầu tiên của phƣơng pháp phân tích. Từ đƣờng chuẩn ta có thể biết đƣợc khoảng tuyến tính của chất phân tích, từ đó đƣa nồng độ mẫu thực nằm trong khoảng tuyến tính. Chúng tơi đã tiến hành xây dựng đƣờng chuẩn nhƣ sau.
Pha các dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ: 5; 10; 40; 80; 160 ng/ml. Tiến hành bơm vào thiết bị LC-MS/MS với các điều kiện khảo sát để xác định sự tƣơng quan giữa nồng độ chất phân tích và độ đáp ứng của thiết bị (độ đáp ứng về diện tích).
Kết quả khảo sát các thông số biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ của chlorothalonil và diafenthiuron và diện tích píc tƣơng ứng đƣợc thể hiện trong bảng 3.5.
ảng 3.5: Sự phụ thuộc giữa nồng độ và độ đáp ứng diện tích píc
Tên các chất chuẩn Thời gian lƣu (phút) Nồng độ (ng/g) Độ đáp ứng diện tích píc Chlorothalonil 2,025 5 109,45 10 218,15 40 850,21 80 1615,56 160 3302,21 Diafenthiuron 5,65 5 154,37 10 311,54 40 1235,62 80 2502,91 160 3149,15
Hình 3.2: Đường chuẩn diafenthiuron Hình 3.3: Đường chuẩn chlorothalonil Bảng 3.6: Thơng số đường chuẩn chlorothalonil và diafenthiuron
Tên hoạt chất Hệ số hồi quy Công thức bậc nhất
Chlorothalonil 0,99967 y= 6,4589x+82,988
Trong thiết bị phân tích, phần mềm Agilent-Mass Hunter B1.0 giúp lập đƣờng chuẩn tự động.
Kết quả phân tích cho thấy phƣơng trình hồi quy của chlorothalonil dạng bậc nhất: y= 6.4589x+82.988 trong đó y là diện tích pic, x là nồng độ chất chuẩn bơm vào (ng/ml); hệ số tƣơng quan r2 = 0,99967. Phƣơng trình hồi quy của diafenthiuron. y = 944,81729 x+176,339 với hệ số tƣơng quan r2
= 0,9994. 3.2.2. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn xác định (LOQ)
Trên cùng một phƣơng pháp phân tích tại các phịng thí nghiệm khác nhau sẽ công bố các giới hạn phát hiện và giới hạn xác đinh khác nhau tuỳ thuộc vào tay nghề của nhân viên, sự hoạt động ổn định của máy móc thiết bị và chất lƣợng của các hoá chất/chất chuẩn.
Trong trƣờng hợp các yếu tố nêu trên không đảm bảo yêu cầu, giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp sẽ tăng lên nhiều lần so với khuyến nghị của phƣơng pháp gốc. Do đó, việc xác định và công bố giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp sẽ thể hiện đƣợc năng lực của phịng thí nghiệm.
Giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp là giới hạn thấp nhất của chất cần phân tích có thể định lƣợng đƣợc bằng cách phân tích đáp ứng đƣợc yêu cầu về độ chính xác. Giới hạn định lƣợng thƣờng lớn hơn giới hạn phát hiện của phƣơng pháp. Giới hạn phát hiện (LOD) của một phƣơng pháp phải đƣợc tính trên nền thật của mẫu và trải qua tồn bộ các bƣớc xử lí mẫu. Do đó giá trị này chính xác nhất cho việc đánh giá một phƣơng pháp phân tích. Có nhiều cách để xác định giới hạn phát hiện của phƣơng pháp.
3.2.2.1. Xác định giới hạn phát hiện
Xác định giới hạn phát hiện dựa trên mẫu trắng và mẫu thêm chuẩn, mẫu trắng là mẫu không chứa hoạt chất cần phân tích. Thêm một lƣợng chất chuẩn đã biết trƣớc nồng độ vào mẫu trắng sao cho tỷ lệ mẫu trên đƣờng nền (signal to noise trong khoảng từ 3 đến 10) và thực hiện lặp lại 10 lần sau đó tính LOD theo cơng thức:
LOD = Cblank+ 3 SD Trong đó LOD: giới hạn phát hiện
SD: độ lệch chuẩn mẫu trắng thêm chuẩn
Để xác định Cblank và SD, tiến hành n thí nghiệm để xác định các kết quả đo mẫu thêm chuẩn, từ đó thu đƣợc các giá trị kết quả Cbi (i từ 1 đến n). Ta tính đƣợc
n C Cblank bi 1 ) ( 1 n C C SD n i blank bi
Hình 3.4: Sắc ý đồ mẫu trắng rau cải Hình3.5: Sắc ý đồ mẫu trắng rau mùng tơi
3.2.2.2. Xác định giới hạn định lƣợng
Giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp là giới hạn thấp nhất của chất cần phân tích có thể định lƣợng đƣợc bằng cách phân tích đáp ứng đƣợc yêu cầu về độ chính xác. Giới hạn định lƣợng lớn hơn giới hạn phát hiện của phƣơng pháp.
Giới hạn định lƣợng đƣợc xác định theo công thức LOQ = 3xLOD
Tiến hành phân tích 10 mẫu thêm chuẩn tại mức nồng độ 5 ng/ml thu đƣợc kết quả tính tốn giới hạn định lƣợng và giới hạn phát hiện nhƣ sau.
Bảng 3.7: ác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng chlorothalonil
Mẫu trắng thêm
chuẩn Nồng độ thêm chuẩn
Thời gian lƣu Diện tích nồng độ thu hồi (ng/g) 1 5 ng/g 2,056 112 5,04 2 5 ng/g 2,052 110 4,95
4 5 ng/g 2,055 109 4,92 5 5 ng/g 2,054 110 4,95 6 5 ng/g 2,055 108 4,9 7 5 ng/g 2,054 106 4,87 8 5 ng/g 2,046 109 4,92 9 5 ng/g 2,065 112 5,04 10 5 ng/g 2,056 107 4,9 Trung bình 4,95 STDEV 0,061 %RSD 1,223 LOD 3,670 LOQ 11,010
Bảng 3.8: ác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng diafenthiuron
Mẫu trắng thêm
chuẩn Nồng độ thêm chuẩn
Thời gian lƣu Diện tích nồng độ thu hồi (ng/g) 1 5 ng/g 5,635 152 4,97 2 5 ng/g 5,648 148 4,82 3 5 ng/g 5,638 154 5,01 4 5 ng/g 5,639 160 5,05 5 5 ng/g 5,629 158 5,03 6 5 ng/g 5,633 142 4,8 7 5 ng/g 5,629 158 5,03 8 5 ng/g 5,631 154 5,01 9 5 ng/g 5,628 159 5,04 10 5 ng/g 5,615 149 4,89 Trung bình 4,965 STDEV 0,094 %RSD 1,890 LOD 5,670 LOQ 17,010
3.2.3. Đánh giá độ chính xác của phƣơng pháp
Độ chính xác của phƣơng pháp phân tích có ý nghĩa đánh giá phƣơng pháp phân tích có khả năng ứng dụng hay khơng (từ dung mơi chiết mẫu, chất làm sạch, và các điều kiện tối ƣu hóa trên thiết bị). Theo ISO 5725:1994 độ chính xác của phƣơng pháp (accuracy) đƣợc đánh giá qua độ đúng (truness) và độ chụm (precision) [16].
Trong đó độ đúng đƣợc đánh giá qua độ chệch – Bias (tƣơng đƣơng với hiệu suất thu hồi – Recovery) bao gồm độ chệch trong nội bộ phịng thí nghiệm (Laboratory bias) và thử nghiệm liên phòng. Với độ chụm chúng tôi đánh giá qua độ lệch chuẩn lặp lại.
Độ chụm là đại lƣợng dùng để chỉ mức độ gần nhau của các giá trị riêng lẻ xi của các phép đo lặp lại. Nói cách khác độ chụm đƣợc dùng để chỉ sự sai khác giữa các giá trị xi so với giá trị trung bìnhx, đại lƣợng đặc trƣng cho độ chụm là độ lệch chuẩn tƣơng đối %RSD (hay còn đƣợc gọi là hệ số biến thiên CV) đƣợc tính theo các công thức dƣới đây: [10].
100 (%) tb S SD RSD
Trong đó: SD là độ lệch chuẩn của diện tích hoặc kết quả của n lần chạy